胶质细胞转分化神经元争议颇多，张春立发文证伪此前研究
事件： 日前在 Cell 上刊登的一篇以题为 “ Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo ” 的文章引起业内的广泛讨论。 该研究运用谱系追踪法系统地证明过表达 NEUROD1 或敲低 Ptbp1 并不能把体内星形胶质细胞转分化为神经元。 那些所谓的 “新生神经元” 只不过是大脑本身的原位神经元。这从本质上完全否定了之前业内发表的一系列高点数相关文章。笔者试问，若在新生神经元不存在的情况下，所谓的神经组织修复以及功能修复将如何解释？
回顾 1： 近年来，暨南大学粤港澳中枢神经再生研究所陈功教授报道通过 AAV 病毒载体过表达 NEUROD1 基因可将大脑中的星形胶质细胞转分化为神经元，并在多种小鼠脑损伤和神经退行性疾病模型中取得功能修复改善；相关研究也准备推向临床。而该篇 Cell 文章从根本上否定了陈功教授所报道的 NEUROD1 对体内胶质细胞转分化为神经元的能力。相继一篇以题为 《独家专访：陈功教授解读胶质细胞向神经元转分化的研究争议》 的采访再次引起了业内业外人士的广泛讨论？将矛盾推向风口浪尖。
回顾 2： 去年加州大学圣地亚哥分校付向东团队和中科院神经所研究员杨辉团队相继报道的敲低 Ptbp1 基因可以实现星形胶质细胞向神经元的转分化现象同样被此次的 Cell 文章所否定。另外近期，约翰斯 - 霍普金斯医学院的 Seth Blackshaw 教授实验室发布了预印版论文，利用遗传谱系示踪和单细胞测序追踪，通过传统基因敲除方法（不涉及使用工具病毒）明确地展示了去除 Ptbp1 无法将视网膜的穆勒胶质细胞，或者皮层、纹状体、黒质的星形胶质细胞转变成神经元。从另一角度支持了该篇 Cell 论文。
采访： 对此，生辉联系到了本篇 Cell 论文的通讯作者张春立教授，就有所争议的问题进行了 求证和探讨，以下为访谈实录以及张春立团队提供的示意图，生辉不改变原意的详细整理：
张春立是美国德克萨斯大学西南医学中心教授，自 2008 年起，其实验室就专注于神经细胞再生和胶质细胞可塑性的研究，除此之外，实验室也致力于神经退行性疾病的研究。张春立团队于 2013 年报道了 SOX2 介导的小鼠大脑纹状体内胶质细胞向神经元转分化的现象，并进行了多重化验证，成为开拓体内诱导神经再生的先驱者。
提问 1：生辉： 近十年来在许多高影响因子杂志上都陆续发表了胶质细胞可以转分化为神经元的文章，可信度关注度都很高，你是出于什么目的来做这项研究？
张春立： 我们实验室自 2008 年开始在体内筛选了很多分子，曾多次观察到病毒荧光标记物在内源性神经元中泄漏表达的现象。因此仅凭病毒载体荧光标记物来判定产生新生神经元是十分武断的。此前一些报道中正是观察到了 AAV 病毒载体荧光标记物在内源性神经元中的泄漏表达，误以为是诱导产生了 “新生神经元”。 这种假象其实在业内早就被诸多实验室所熟知。 然而这两年越来越多的类似的文章蜂拥而至，关于转分化现象本身的证据严重不足，缺乏在细胞水平对 “胶质细胞向神经元转分化” 的验证和支持，并且仅凭假象便开始将 “新生神经元” 的应用深入到各种神经组织修复，功能修复，以及疾病治疗的探索中。尤其是近期即将运用到临床研究，这让我们十分惊讶。细胞来源尚且不清，如何能将这些研究转向临床？因此我们不该对假象放任也不能继续放任，使得大量的科研基金人力物力无端消耗。如果继续放任自流，将产生未来不可避免的重创，这会给公众带来负面影响，大大降低对科学家的信任，使整个领域失去合理的支持和信任。
提问 2：生辉： 你的文章发表后，陈功教授也接受了国内媒体的采访，并指出你在试验中用到的 AAV 滴度过高，对大脑组织产生了损伤，引起了神经元的泄漏，你怎么看？
张春立：我非常赞同在病人治疗上探讨病毒剂量曲线十分必要和重要，但是在基础研究中，病毒滴度是根据具体实验条件而定的。
首先， 我们每一项实验中对照组和 NEUROD1 组都是用的同等滴度的病毒，但只有在 NEUROD1 组才发现在内源神经元中有大量泄漏表达。这一结果直接证明神经元的大量泄漏是跟 NEUROD1 有关而跟病毒滴度无关。
其次， 我们选择使用 AAV 的合适滴度是参考很多文献和打到大脑之后实际的感染效率而定。我们在实验前期使用与陈功教授所用病毒一致的滴度注射，结果发现只有少量细胞被感染。而我们文中最终使用的滴度 所展示的感染效率与陈功教授文章中显示的基本一致甚至稍低（图一）。
图一：争议双方所展示的实际病毒感染效率。左侧为陈功教授文章中的感染效率，绿色荧光标记 ( Chen et al., 2020 )；右侧为张春立教授文章中感染效率，红色荧光标记。
再次， 有文献证明，同一批病毒送到 16 个不同实验室测量病毒滴度，结果显示，不同实验室测出来的结果相差了 100 倍（PMID: 25275822）。 所以同一实验室的滴度测定纵向比较是稳定的，而不同实验室之间的横向比较是有很大区别的。 因此仅从数字上横向比较，我认为没有什么意义。
最后， 当病毒定点注射到脑内后， 其滴度是随着扩散由中心到周围逐渐降低的。 如图二所示，标记为 6 的区域是离注射点较远和病毒量很低的区域，但在这一区域，我们仍然观察到 NEUROD1 组在内源神经元中的泄漏（红色荧光），没有任何被胶质细胞示踪的黄色荧光（YFP）所标记。
图二：张春立教授组用胶质细胞示踪小鼠显示极低病毒的作用区 NEUROD1 仍然产生在神经元泄露表达的假象。
综上所述，我完全不赞同陈功教授关于病毒滴度的论断。值得一提的是陈功教授自己至今也没有这方面的任何实验数据来支持他的论断。
提问 3：生辉： 陈功教授指出，在你的这篇 Cell 文章里（图 1I、图 1L、图 3H），完美地展示了在皮层损伤模型上，NEUROD1 组比对照组有非常好的神经组织修复，你如何解释？
张春立： 做脑外伤或者中风等研究的人都知道，对损伤后有无组织修复以及修复程度如何，需要很多实验动物和做大量脑片的统计学分析后才能得出结论。而陈功教授 仅凭某些局部组织照片就能得出一重大结论也是让人无语。
提问 4: 生辉： 陈功教授指出在图 3L 中的失踪胶质细胞正在发生转分化，只要再观察一段时间就能够看到转分化，而你的团队只观察了 17 天，时间是否太短？
张春立： 我们是参照陈功教授发表的论文而选定了 17 天。事实上，我们也做了 2 个月，3 个月的试验，但仍然没有观测到 NEUROD1 可使胶质细胞转化为神经元。至于胶质细胞形态的变化我们在文章的图形摘要（graphic abstract）中有描述。实际上胶质细胞变形是在很多条件下都能检测到的现象，与其是否转化成神经元没有直接联系。
提问 5: 生辉： 陈功教授表示去年已经发表文章证明 NEUROD1 能够将转基因小鼠的胶质细胞转分化，不理解为什么你的团队没有看到。这个问题你怎么看？
张春立： 陈功教授去年发表的文章（ Xiang et al., 2020 ）中的确用到了胶质细胞谱系示踪小鼠，但 实验设计有缺陷，实验结果与实验结论不符。 他们没有用带荧光标记的 NEUROD1 病毒去感染，因此没有任何证据证明那些谱系示踪标记的神经元是真正由于 NEUROD1 而产生的。仅凭在该谱系小鼠皮层的某些区域找到了追踪神经元，完全不能证明它们是 NEUROD1 感染的胶质细胞转分化而来。实际上在少量谱系示踪小鼠中本身就存在神经元中泄漏表达的现象，且泄漏水平分布不均匀。所以我们在 Cell 文章中特别指出，对谱系示踪小鼠的使用要严格而谨慎，这样具有神经元泄漏表达的小鼠应该从实验中剔除而不用于分析。
提问 6：生辉： 作为开拓体内诱导神经再生的先驱者，你如何看待胶质细胞分化为神经元这件事情？
张春立： 我们实验室十多来年的工作已经明确证明 胶质细胞可以体内重编程而产生神经元， 但是与我们这篇文章所反驳的假象是截然不同的。我们所证明的小鼠大脑和脊髓内的新生神经元都能很好的 被 BrdU 示踪，证明其不同于原位神经元而是新生神经元 （BrdU 能在细胞分裂 DNA 复制的时候插入基因组，因此不会标记不能进行细胞分裂的内源性神经元）； 同时我们所检测到的新生神经元能够很好的被相应的胶质细胞示踪品系追踪，证明了其来源于胶质细胞。因此，胶质细胞在成年小鼠体内确实可以变成神经元，这种转分化方法而产生的新生神经元仍然可以成为今后神经再生功能修复的基础。
提问 7： 生辉：既然你对这些纯属假象的文章有着十分深刻的认识，为什么在长达几年的时间内你或者其他业内人士没有进行证伪？
张春立： 访谈开始我就说过这种假象被业内人士熟知，但是我相信大家都想将自己的研究精力和经费用于真正脚踏实地的有意义的课题上，而不是将人力物力用于证伪。可是放任的结果竟然是不堪设想的，大量的科研基金人力物力无端的被消耗掉，同时在基础研究证据不足的情况下启动临床试验是对病人的不负责任，未来的重创会使公众失去对科学家乃至基础研究本身的信赖与支持。作为业内人士，我鼓励大家发声，不应该继续沉默和无视，这样才能使科学研究健康发展。
