2.1. 神经肌肉病

近年来，AAV介导的基因治疗在DMD、SMA等神经肌肉病中有了突破性的进展。目前的基因治疗药物研发以体内增补为主，基因编辑较少。2019年5月，美国FDA批准Zolgensma用于治疗2岁以下SMA患者，2022年1月该药通过中国国家药品监督管理局药品审评中心(Center for Drug Evaluation，CDE)的临床试验许可。Zolgensma是目前首个也是唯一获得批准用于SMA基因治疗的药物。Zolgensma通过AAV9载体引入人 SMN1 基因，为单次静脉注射给药，可透过血脑屏障，直接增加体内SMN的蛋白质表达，长期改善患者生活质量，具有良好的安全性和有效性 ^{[ 14 - 15 ]} ，但在部分患者中出现的不良反应仍然不容忽视。2022年2名儿童在接受Zolgensma治疗后死于急性肝功能衰竭 ^{[ 16 ]} 。2022年6月，中国自主研发的 SMN1 基因增补治疗药物EXG001-307注射液(CXSL2200146)的临床试验获得中国CDE批准，成为国内首个被批准进入注册临床试验的I型SMA静脉注射基因治疗药物。该产品对AAV载体进行了创新设计，目的在于减轻对心脏和肝脏的副作用以更好地发挥疗效；随后2022年10月，通过鞘内注射给药的CG101AAV注射液获得临床试验许可，用于治疗I型及II型SMA，2023年4月获批用于III型SMA临床试验。

DMD的基因治疗进入临床应用阶段，针对基因治疗的递送方式也在不断改进，从物理递送、非病毒载体递送、病毒载体递送发展到组织特异性病毒载体。目前，在美国临床试验注册中心( https://www.clinicaltrials.gov/ )和欧盟临床试验登记中心( https://www.clinicaltrialsregister.eu/ )注册的关于AAV介导 DMD 基因治疗的临床试验有10余项，主要研究策略包括：终止密码子通读、外显子跳跃、载体介导的基因替代治疗、基因编辑治疗 ^{[ 17 ]} 。由于 DMD 基因外显子数量庞大，是已知的人类最大基因(2.4 Mb)，而AAV载体容量仅约4.7 kb，目前有研究 ^{[ 18 - 19 ]} 通过双重AAV技术和慢病毒载体提高基因载体的容量，有望装载全长的 DMD 基因。Sarepta Therapeutics、Pfizer和Solid Biosciences公司主要致力于 DMD 基因治疗的开发，且都开发了AAV递送小型 DMD 基因治疗 ^{[ 20 - 21 ]} 。2023年6月，Sarepta公司与罗氏（Roche）联合开发的基因治疗产品Elevidys获FDA加速批准上市，用于治疗4至5岁DMD儿童患者。前期部分研究 ^{[ 22 ]} 数据显示DMD基因治疗具有一定的有效性及安全性；但在临床试验PF-06939926中，1例失去独立行走能力的DMD患者在参加Ib期临床试验后死亡，III期临床试验中也有3名DMD患者出现肌肉无力、急性肾损伤和血小板下降，多在给药后的最初几周发生 ^{[ 23 ]} 。近年规律性重复短回文序列簇(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR-associated nuclease 9，Cas9)技术被广泛应用 ^{[ 24 ]} ，通过注射rAAV包装的Cas9和gRNA，可以恢复抗肌营养不良蛋白表达，改善肌肉收缩能力，表明CRISPR/Cas9系统技术用于纠正导致DMD的多种遗传突变，并为永久治疗DMD提供了方向 ^{[ 25 - 26 ]} 。Tabebordbar等 ^{[ 27 ]} 开发了一种靶向肌肉组织的新型AAV载体即MyoAAV，其具有特异性靶向肌肉组织、治疗剂量较低、肝毒性低等优点，MyoAAV的出现进一步推动了AAV在神经肌肉病中的应用。

2.2. 溶酶体病

溶酶体病常累及多个器官和系统，70%的患者有显著的中枢神经系统症状 ^{[ 28 ]} 。血脑屏障的存在限制了酶替代疗法治疗溶酶体病的效果，AAV介导的基因疗法在动物实验和临床试验中都表现出显著的优越性和安全性，在儿童庞贝病，黏多糖贮积症(mucopolysaccharidosis，MPS)，神经元蜡样脂褐质沉积症(neuronal ceroid lipofuscinoses，NCL)2、3、6、7型，异染性脑白质营养不良病(metachromatic leukodystrophy，MLD)，神经节苷脂贮积症，I型和II型戈谢病等中开展了多项临床研究 ^{[ 29 ]} 。目前已注册多项AAV介导的儿童庞贝病基因治疗的临床试验，基因治疗产品主要为美国佛罗里达大学研发的用于晚发型庞贝病治疗的rAAV1-CMV-GAA，以及中国锦篮基因科技有限公司研发的用于婴儿型庞贝病治疗的GC301，二者分别使用AAV1、AAV9血清型载体，通过肌肉注射、静脉注射方式进行基因替补治疗(表 1 、 2 )。通过麻醉后胸腔镜辅助下膈肌注射给药[AAV1-巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)-酸性α-葡糖苷酶(acid alpha-glucosidase，GAA)]，可改善晚发型庞贝病患者的呼吸功能，数据显示该研究安全、有效 ^{[ 30 - 31 ]} 。北京锦篮基因科技有限公司开发的GC301腺相关病毒注射液治疗庞贝病的临床研究数据有待进一步更新。在MPS中AAV介导基因治疗的临床试验研究主要集中在MPS I、II、III、VI型患者，儿童患者中共计注册10项，采用血清型AAV9、AAV2/6、AAVrh10、AAV2/5、AAV2/8，通过脑室注射、静脉注射、脑实质注射方式进行基因治疗。目前有4项(3种基因治疗药物)3期临床试验正在进行患者招募。部分前期研究 ^{[ 32 - 34 ]} 结果显示：在MPS I型、II型患者中，AAV介导的基因治疗耐受性良好，无严重的治疗相关不良事件；治疗后患者酶活性增加，与自然病程相比，患者神经认知水平有一定程度的提高。

2.3. 癫痫和发育性癫痫性脑病

癫痫和发育性癫痫性脑病是发现新致病基因的重点领域。尽管抗癫痫发作药物不断研发上市，但仍有25%~30%的癫痫患者为药物难治性癫痫。关于基因治疗癫痫的临床研究及应用远远落后于神经肌肉病、溶酶体病和其他遗传罕见病。特别是离子通道基因变异导致的癫痫及发育性癫痫性脑病，涉及复杂的基因功能改变，包括功能获得型、功能丧失型、功能获得和丧失型，让基因治疗变得较为复杂。 SCN1A 基因变异导致的Dravet综合征是遗传性癫痫的代表，由于 SCN1A 基因较大，含有26个外显子，而且 SCN1A 基因在体外复制时容易产生新发变异，稳定性较差，在大肠杆菌感受态扩增 SCN1A 质粒时每次扩增均需要进行测序，因此通过AAV递送 SCN1A 基因受限。AAV9-RE(GABA)-eTF(SCN1A) (ETX101)是一种靶向γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)能抑制性神经元的基因疗法，通过AAV递送 SCN1A 特异性转录因子eTF(SCN1A)和GABA能调节元件，以上调 SCN1A 基因在受影响的抑制性神经元中的表达水平，发挥抗癫痫作用。杂合Dravet小鼠经侧脑室单次给药后，小鼠的存活率增加，热性惊厥发作的阈值升高且自发性癫痫发作次数减少 ^{[ 35 ]} ，现已进入I/II期临床试验阶段( {"type":"clinical-trial","attrs":{"text":"NCT05419492","term_id":"NCT05419492"}} NCT05419492 ， 表1 )。此外，还有其他AAV介导的基因疗法在Dravet综合征的动物实验中显示出有效性，如通过脑室注射AAV9载体递送NaVβ1，或静脉注射AAV-PHP.eB载体递送CRISPR/cas9、gRNA，均可以改善小鼠表型 ^{[ 36 - 37 ]} 。CG01是一种基于AAV的基因治疗药物，目前处于临床前研究阶段，可以将神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)及其受体Y2递送到脑内特定区域，并稳定表达，目前未发现其在认知和体重方面的不良反应 ^{[ 38 ]} 。相信越来越多癫痫相关基因治疗临床研究的开展会改变诊疗模式，为药物难治性癫痫的治疗带来新希望。