李晶团队：神经内分泌前列腺癌的单细胞转录调控和遗传进化

交叉学科

Interdisciplinary

近日，海军军医大学转化医学研究中心李晶团队在Cell Press 旗下交叉学科期刊iScience上发表了题为“Single-cell transcriptional regulation and genetic evolution of neuroendocrine prostate cancer”的研究论文，通过单细胞转录组测序（scRNA-seq）联合外显子组测序、Bulk转录组测序等多组学分析，①鉴定并验证了两个代表神经内分泌前列腺癌（NEPC）在演进不同阶段的特异性表达特征；②揭示了前列腺腺癌（ADPC）可以在任何治疗阶段转分化为NEPC；③NEPC的转分化是动态变化的过程；④在不同阶段参与NEPC的关键转录因子亦是不同。该研究拓展了NEPC起源的假说并为临床分子诊断提供了数据支撑和理论依据。

相关背景

NEPC是一种致命的前列腺癌亚型，五年生存率为10%，常常在ADPC患者出现激素抵抗时出现，是ADPC由激素敏感型（HSPC）转变为激素抵抗型（CRPC）的重要原因之一。然而目前对它的起源及转变的机制知之甚少。由于ADPC和NEPC相互混杂，既往基于大块组织（Bulk）测序技术的NEPC研究难以特异性捕捉NEPC特异性表型及动态变化过程。近年来包括scRNA-seq在内的一系列单细胞组学的发展突破了Bulk测序的瓶颈，使得在单细胞水平捕捉细胞表型和瞬时动态变化成为可能。

结果解读

1.鉴定了前列腺癌中的恶性肿瘤细胞

为了推动对NEPC起源和变化机制的理解，李晶团队首先对临床/病理诊断为神经内分泌分化（NED）的2例HSPC和5例CRPC的肿瘤样本进行scRNA-seq测序，构建了包含36,036个高质量细胞的单细胞图谱。通过整合分析单细胞拷贝数变异（inferCNV），配对的全外显子测序数据（Bulk WES-seq）和两个已发表的前列腺癌转录组测序数据（Bulk RNA-seq），鉴定了7例肿瘤样本中的恶性肿瘤细胞分群（图1）。

图1. 来自7例前列腺癌患者36,036个细胞的单细胞图谱

2.鉴定了两种不同的NED基因表达模块

为更好地研究肿瘤间的共性，该团队采用了共识非负矩阵分解（cNMF）的算法，将7例样本的肿瘤细胞转录谱拆解为71个相对独立的基因表达程序（GEP），并通过相关性聚类算法将71个GEP聚合成11个具有特定生物学功能的独立模块。找到了两个模块同NEPC表型有关，NE1和NE2。GO功能注释结果表明，NE1模块同细胞命运决定和神经上皮分化有关，而NE2模块同神经内分泌囊泡转运和分泌功能有关。NE1主导的细胞群高表达ASCL1，该基因编码了一个促进细胞重编程和神经元分化的重要转录因子（TF），而NE2主导的细胞群高表达CHGB，该基因编码了一个表征神经内分泌细胞的功能蛋白。经外部验证数据集验证，NE1和NE2模块中的基因在NEPC中较ADPC显著富集（图2）。

图2. cNMF算法揭示了独特的表达模块

3.P5同时表达两种NED模块且位于同一克隆亚群

随后，该团队探究了两个NE模块在个体患者中NEPC分化过程中的关系。5号患者（P5）包含了3个GEP（id=5, 9, 14），3个GEP主导的细胞在UMAP图中分别位于同一簇的不同区域。根据cNMF分析结果，GEP9属于NE1，相关细胞群高表达ASCL1基因，GEP5和GEP14属于NE2，相关细胞群高表达CHGB基因。Velocity分析表明，该细胞簇的细胞分化方向为NE1→NE2，提示NE1模块代表了神经内分泌分化（NED）早期，而NE2模块代表了NED的中晚期。此外，inferCNV分析发现，NEPC细胞同ADPC细胞具有相似的CNV改变，这一结果支持NEPC起源于已有的ADPC克隆而非区别于ADPC的独立克隆（图3）。

图3. P5中的NEPC转分化过程

4.P3同时表达两种NED模块且分属不同克隆亚群

该团队在P3中则观察到了更为复杂的CNV事件。P3的肿瘤细胞总体表现为2号染色体p段的扩增（chr2p+）和13号染色体q段的缺失（chr13q-），但同时有部分细胞在携带上述CNV改变的同时还存在chr12q+和chr15q-，提示该群细胞是通过新的基因组事件而产生的独立亚克隆。联合cNMF中鉴定出的NE亚型，发现亚克隆由NE1细胞和AD细胞组成，主克隆由NE2细胞和AD细胞组成，提示NEPC起源于已有ADPC克隆，且ADPC在不同遗传背景下发生了独立的NED事件（图4）。

图4. P3中的肿瘤克隆进化

5.探究了P1样本中的肿瘤克隆进化模型

P1临床诊断为HSPC，伴腹股沟淋巴结肿大和全身骨转移。由于患者PSA水平不高（8.63 ng/μl），因此临床怀疑NEPC分化。尽管病理学提示神经内分泌标志物阴性，但单细胞图谱证实，该样本中存在表达 ASCL1和CHGB的NE2细胞。病理检查的假阴性结果可能由于NED极少细胞计数，这也提醒了前列腺癌的空间异质性和穿刺活检的局限性。该团队发现，尽管ADPC细胞表达AR，但仅有少量细胞表达KLK3（编码临床诊断标志物PSA的基因），该群细胞同inferCNV分析中鉴定出的chr3q+细胞群高度重合，而同NEPC细胞群互斥，提示NEPC起源于KLK3阴性且未经治疗的ADPC细胞，且在克隆进化过程中，ADPC通过chr3q+事件恢复了KLK3的表达。基于此，该团队构建了P1的肿瘤进化模型（图5）。

图5. P1中的肿瘤克隆进化

6.识别调控不同NED模块的转录因子

研究至此表明，这些具有不同遗传改变的异质性ADPC可以演进为具有相似表型的NEPC。该团队假设这种转变是由于表观遗传的驱动因素，因此通过基于基因共表达网络的pySCENIC算法识别了调控NED不同阶段的TF，这些TF代表了潜在的表观遗传驱动因素。鉴定了包括NE1特异性的NKX2-2，NE2特异性POU3F2和SOX2，以及NE1和NE2共享的ASCL1和FOXA2等NED分化中的重要TF（图6）。

图6. NEPC的TF调控机制

总结

本研究揭示了ADPC演变为NEPC的两种路径。一方面，随着肿瘤从HSPC发展为CRPC，遗传事件定义了ADPC的克隆进化，另一方面，TF或表观遗传驱动的层次结构定义了 ADPC向NEPC 的转分化。此外，本研究强调了ADPC到NEPC的表观遗传重编程可以发生在ADPC自身进化轨迹的多个阶段。

本论文由来自海军军医大学李晶课题组、厦门大学黄佳良课题组、海军军医大学第一附属医院许传亮课题组和华盛顿圣路易斯医学院Hyung Joo Lee课题组共同合作完成，通讯作者为李晶、黄佳良、Hyung Joo Lee、许传亮，第一作者为王子威、汪涛、洪丹妮、董柏君。

相关论文信息

研究成果发表在Cell Press旗下iScience期刊上，点击“阅读全文”或扫描下方二维码查看论文。

▌论文标题：

Single-cell transcriptional regulation and genetic evolution of neuroendocrine prostate cancer

▌论文网址：

https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(22)00848-3

▌DOI：

https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.104576

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