マウスは、悪性腫瘍を含むヒト疾患の研究のための古典的なモデル生物として機能している。哺乳類として、彼らは人間と多くの類似点を共有しています。それらの高度な遺伝的類似性は、ヒト疾患の遺伝的制御に対する巨大な洞察を提供するために、マウスゲノムのトランスジェニック操作を可能にした ^1. マウスの取り扱いと実験に関する豊富な経験は、その結果、生物医学研究のための選択のモデルとなっています。しかし、マウスモデルに関する倫理的および科学的な懸念に加えて、彼らはまた、非常に高価で時間がかかる可能性があります ^{2 , 3} .腫瘍の発症には数週間から数ヶ月かかる場合があります。典型的な施設の住宅だけでも、腫瘍が発達している間、数百〜数千ドルで実行することができます。卵巣癌は、マウスモデルの成長が容易に数ヶ月かかることがあるため、この欠点の一例である。研究の進行の遅れは、卵巣癌患者の持続的に低い5年生存率にわずか47%(すなわち、30年間でわずか10%の生存率の増加)に影響を与える可能性 ^4。 同様に、泌尿器科癌(腎臓、前立腺、膀胱癌)は、米国における全癌症例の19%、癌関連死の11%を占めている ^4。 したがって、婦人科癌と泌尿器科癌を研究するための新しいインビボアプローチは、たとえこのモデルが最初のスクリーニング実験にのみ適用されるとしても、実験室にかなりの時間、労力、そしてお金を節約できる。さらに、結果として得られる研究結果の加速は、これらの癌と診断された177,000人の個人に大きな影響を与える可能性があります。

Chicken CAMモデルは、前述の問題に対処する多くの利点を提供します。 ^{血管 新生 5、6、 腫瘍細胞浸潤 7、8、 転移 7、9 を研究する一般的な モデルは、神経膠腫 10、11、12、 頭頸部および頸部扁平上皮癌 13、14、 白血病 15、16、膵臓癌17、膵臓癌17、および膵臓 癌 17、 および癌の多くの形態を研究するために既に使用されている 大腸癌 18 .さらに、CAMモデルは、神経芽細胞腫 19、 バーキットリンパ腫 20、 黒色腫 21、 およびネコ線維肉腫 22 に対して生成されている。以前の研究では、膀胱癌 23 および前立腺癌細胞株 24 の生着も提示されているが、プロトコルの詳細は限られている。卵はマウスよりずっと安いだけでなく、再現性の高い結果 25、26 を生み出す。それらは速い血管系の発達を示し、腫瘍の生着は数日の速さで起こり、開いた窓を通して縦方向に視覚化することができる。卵子受精と孵化の間の21日の時間枠で、実験は数週間以内に完了することができます。さらに、低コスト、限られた住宅ニーズ、および小型は、マウス研究のために禁止される大規模な実験を容易に可能にする。}

そこで、婦人科がんや泌尿器科がんの生着に向けてCAMモデルを最適化することを検討しました。初期の鶏胚 ²⁷ の免疫不全状態のために、マウスおよびヒト細胞の両方を容易に移植することができる。したがって、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌の生着に成功しました。これらの腫瘍タイプのそれぞれについて、CAMは確立されたマウスおよび/またはヒト腫瘍細胞株を容易に受け入れる。重要なことに、採取された新しい原発性ヒト腫瘍組織は、消化された細胞または高い成功率を有する固形組織の断片から生着することもできる。これらのがんの種類と細胞源のそれぞれは、最適化が必要です。

本書に示された実験はすべて、カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)の適切な倫理委員会によって審査され、承認されました。識別されていない原発性ヒト腫瘍の使用は、UCLA機関審査委員会(プロトコル番号17-000037、17-001169、および11-001363)によって承認されています。UCLAでは、鶏の胚を使用した実験には動物研究委員会の審査は必要ありません。プロトコルの承認は、卵が孵化する場合にのみ必要です。しかし、動物の安楽死のためのAVMAガイドラインなどのベストプラクティスは、鶏の胚を倫理的に処理し、可能な限り痛みを避けるために使用されました。研究者は、CAMモデルを使用して研究を行う前に、機関で監視要件を確認するよう促されます。

1. 卵の準備

1. 卵を受け取る前に、卵インキュベーターを組み立てて37.8°C(100°F)に平衡させ、メーカーの指示に従って湿度60〜70%を調整してください。
   注:汚染のリスクを最小限に抑えるために、オートクレーブされた水を使用して湿度を制御することができます。
2. 認定された実験室グレードの卵サプライヤーから受精したロードアイランドレッドチキンの卵を受け取ると、タオルで殻の表面を乾かして拭きます。軽く湿らせたペーパータオルを使用して、付着した材料を除去することができます。すぐに乾燥します。
   注:43.3 °C未満の液体で殻を濡らすと、卵に細菌を導入することができます。卵を洗浄または消毒することを選択した場合、液体の温度は43.3〜48.9 °Cの間でなければなりません。より高い温度は卵を沸騰させることができます。消毒剤の選択は、懸念を引き起こす微生物に基づいて行われるべきである。
3. 鉛筆やマーカーを使って卵の日付にラベルを付けます。これは開発日 0 と見なされます。
4. 卵インキュベーターに卵を入れ、CAM開発を可能にするために回転して少なくとも7日間インキュベートします。自動回転器を使用するか、または卵が1日あたり180°2-3x回転することができる。

2. 卵を開く

注:CAMが完全に開発されたときに卵の開口部を行う必要があります。これは通常、開発 7 日目または 8 日目です。

1. 70%エタノールでバイオセーフティキャビネットを消毒します。同様に消毒し、バイオセーフティキャビネットに卵ラック、卵のローソーバー、マーカー、シリコンカーバイド砥石と円形切断ホイールを備えたコードレスロータリーツール、18 G針、4分の1インチ真空チューブ付きピペットコントローラ、パッキングテープ、オフィスはさみ、湾曲したはさみ、Semken(または類似)の鉗子、綿のボール、および6 x 7 cmの透明なフィルムドレッシング。可能な限り、滅菌、使い捨てまたはオートクレーブツールを使用してください。
2. 卵の回転子の電源を切ります。約1~3個の卵を卵ラックのバイオセーフティキャビネットに入れます。暗闇の中で、卵のろうそくを卵殻に当て、空気細胞を識別します。空気セルの位置をマークします。
   注:卵のキャンドルからの照明の強度は、卵の内部を視覚化するために重要です。空気細胞や血管系が一貫して見えにくい場合は、卵のろうそくの電池を交換してみてください。
3. 卵のキャンドラーを殻の上に移動して、大きな血管ネットワークを見つけます。必要に応じて卵を回転させます。理想的な血管系は、卵の真ん中付近に分岐します。マーカーを使用して、移植に使用する血管系を描画します。
4. ボンネットのライトを点灯します。シリコンカーバイド砥石を取り付けたコードレス回転工具を使用して、空気セルの中心にシェルに小さな穴を開けます。シェルの大部分が取り除かれるまでドリルしますが、白い内膜はそのままです。
   注:血管系をターゲットにする前に空気セルを掘削することで、CAMや脈管構造ではなく、空気セル上の特定の卵殻の厚さを決定できます。CAMまたは血管系が破壊された場合、卵は移植に使用できません。
5. ドリルと空気細胞のために行われたように、血管窓が開く別の小さな穴を開きます (ステップ 2.4).
6. 18G針を使用して、空気細胞と脈管構造の上に白い内膜をそっと突き刺します。シェルを貫通できない場合は、もう少し慎重にドリルします。白い内部膜(CAMではない)が掘削された領域全体全体にわたって破壊されていることを確認します。膜片の除去は必要ではない。
   注: この手順で CAM または血管系が乱れた場合は、卵を捨てます。穴の開いた穴から血液やアルブミンが漏れている場合、損傷は明らかです。
7. フードライトを消します。卵のろうそくを使用して、空気細胞が卵の端から血管系上の領域に移されたことを確認します。必要に応じて、元の空気セルの穴の周りにピペットコントローラに挿入された真空チューブを配置し、短いバーストで吸引を静かに適用して空気セルを移動させます。
8. マーカーを使用して、空気-CAM境界内の約0.5cmのエアセルの新しい位置を輪郭を描きます。新しいエアセルの上に梱包テープを貼り付けます。必要に応じて、標準オフィスハサミを使用してテープを適切なサイズにトリミングします。
   メモ:テープはシェルを通る気流を破壊する可能性があり、エアセルを完全に覆うために必要以上に大きくすべきではありません。
9. 卵をインキュベーターに戻し、新しい空気セルを上に向けて回転せずに温めます。残りの卵を開くには、手順 2.2 ~ 2.9 を繰り返します。
   注: ここでプロトコルを一時停止できます。CAM開発の質が不明な場合は、残りの卵を開く前に、少数の卵がステップ2.16を進める必要があります。
10. 約1~3個の卵を移した空気細胞をバイオセーフティキャビネットの卵ラックに置きます。
    注意:開いた卵に汚染を入れないように注意してください。したがって、常にバイオセーフティキャビネット内の卵を開き、可能な限り滅菌ツールや機器を使用しています。
11. 円形のカッティングホイールを取り付けたコードレス回転ツールを使用して、ステップ2.8で描かれた空気セル境界の上に小さな線をカットします。CAM または血管系を破壊しないように、実際の空気カム境界内で約 0.5 cm であることを確認します。シェルを完全にカットしますが、CAMや血管系を破壊するのに十分な深く浸透しないように注意してください。
12. 湾曲したはさみを使用して、残りの空気セルの周りをカットして、シェルに窓を作成します。
    注:除去されたシェルに血液または膜が存在する場合、卵は移植に適していません。卵の高い割合がきれいに開いていない場合は、より良いCAM形成を可能にするために、残りの卵を開くために少なくとも1日以上待つこと検討してください。残りの卵の殻が突き刺さっていない場合は、インキュベーター内の卵の回転を再開する必要があります。
13. 胚の生存率を確認します。生存可能な胚は、広範な血管系、透明なアルブミン、胚の動き、または目に見える心拍を表示する。
14. セムケンの鉗子を使用して、無菌の綿球から綿の小片を引っ張ります。CAM サーフェスを静かにブロットして、シェルのほこりやデブリを取り除きます。
    注:卵を開いた日に、デブリの除去を行う必要があります。
15. シェル開口部を6 x 7 cm透明フィルムドレッシングの4分の1の部分で覆います。
16. 卵をインキュベーターに戻します。開いた窓を上に向けて、透明なフィルムドレッシングに触れないように卵がしっかりと座っていることを確認してください。卵ラック、卵の回転子の端、または転がり続ける卵を支えるのに適した別のアイテムを使用してください。
17. 残りのすべての卵を開くには、手順 2.10 から 2.16 を繰り返します。
    注:卵の開口部は、移植と同じ日に完了する必要はありません。少なくとも1日待つことは、シェルを開くことによって生存率が損なわれた卵を排除するのに役立ちます。

3. 移植のためのがん細胞懸濁液の準備(オプション1)

注:これは、理想的には7日から10日目の間に行われるべき移植の直前に完了する予定です。移植日に関する詳細については、ステップ5または6の冒頭の注記を参照してください。このアプローチは、すべての細胞株および培養腎臓癌腫瘍消化に使用された。

1. 氷上の細胞外マトリックス溶液を解凍します。
2. 機械的および/または酵素的消化を用いて、移植される細胞型に適した方法を用いて単一細胞懸濁液を得る。
3. 移植用の適切な培地に移植される細胞の総数を再懸濁する。卵1個あたり1~2 ^x106 細胞のインプラントが代表的です。
   注:細胞株の移植に使用される培地は、通常、FBSまたは血清置換を含む細胞を培養するために使用される完全な培地である。腫瘍の消化の移植は、典型的には、同じ癌型の細胞株を培養するために使用される完全な培地を使用する。しかしながら、培地製剤への調整は、実験的に必要に応じて行われてもよい。腫瘍の発達と成長への影響は、経験的に決定する必要があります。
4. 使用する細胞に適した遠心分離機の速度と時間を用いて細胞をペレットにする。一般的な速度は250-300×gで、時間は5〜10分です。
5. ピペッティングによってペレット化された細胞から上清を除去する。フリックまたはピペッティングを介して、残留培地中の細胞を機械的に再懸濁する。氷の上に置き、冷やします。適切なサイズのピペットを使用して、セルと媒体の体積を測定します。
6. 1-2 x 10 ⁶ 細胞が卵1個あたり20〜100μLの体積に移植され、最終的な細胞外マトリックス濃度が2.7〜4mg/mLタンパク質になるように移植量を計算します。培地、任意の必要な成長因子または添加剤、およびこの計算に従って細胞外マトリックス溶液を追加します。インプラント準備ができるまで氷の上に置いてください。
   注: ステップ 3.3 および 3.6 の計算では、グループ内のすべての卵に対して十分な量を確保するために、少なくとも半分の卵インプラントの余分な容積を組み込む必要があります。卵巣癌細胞株(すなわち、SKOV3およびID8)の移植のために、卵1個につき ¹⁰⁶ 個の細胞を移植した。腎細胞癌細胞株RENCAの移植のために、消化されたヒト腎細胞癌、前立腺癌細胞株(すなわち、CWR、C4−2、およびMyC-CaP)、および膀胱癌細胞株(すなわち、HT-1376およびT24)に由来する培養細胞を、2x106細胞移植した。

4. 移植のための腫瘍片の準備(オプション2)

注:これは、理想的には7日から10日目の間に行われるべき移植の直前に完了する予定です。移植日に関する詳細については、ステップ5または6の冒頭の注記を参照してください。原発性卵巣癌および膀胱癌は腫瘍片として移植された。

1. 氷上の細胞外マトリックス溶液を解凍します。任意の所望の成長因子または添加剤を含む適切な培地で2.7〜4 mg/mLの最終タンパク質濃度に希釈します。氷の上に置いておきなさい。
   注:腫瘍片の注入は、通常、同じ癌タイプの細胞株を培養するために使用される完全な培地を使用する。しかしながら、培地製剤への調整は、実験的に必要に応じて行われてもよい。腫瘍の生着と成長への影響は、経験的に決定する必要があります。
2. メスやハサミを使用して、新鮮な腫瘍から切除片。理想的なサイズは、両側に2〜5ミリメートルの範囲です。移植準備ができるまで、組織を培地に浸しておいてください。

5. ノンスティックリングを使用した移植(オプション1)

注:CAMが完全に開発されている場合、細胞は開発7日目から移植することができます。移植は、腫瘍の発生と所望の実験のための十分な時間を可能にする孵化の前にいつでも起こり得るが、胚の免疫細胞が10日目の受精後 ²⁷ の周りに存在し始めることに注意してください。腫瘍の増殖速度は細胞の種類によってかなり異なり、目的の細胞タイプについて経験的に決定される必要があります。卵巣癌および前立腺癌細胞を非スティックリング法を用いて移植した。ノンスティックリングが利用できない場合、ピペットチップを同様のサイズにカットして使用する場合があります。

1. 70%エタノールを使用してバイオセーフティキャビネットと必要なすべてのツールを消毒します:卵ラック、湾曲した虹彩鉗子、ノンスティックリング(1/4インチ内径)、ガラスの攪拌棒、適切なボリュームピペットとチップ、6 x 7 cm透明フィルムドレッシング、オフィスハサミ、およびマーカーまたは鉛筆。可能な限り、滅菌、使い捨て、またはオートクレーブツールを使用する必要があります。
2. バイオセーフティキャビネットの卵ラックに埋め込む卵を置きます。管理可能な卵の数を選択します。最大6が典型的です。卵を一緒に作業しながら、卵が実質的に冷却することを避けてください。
3. 透明なフィルムドレッシングをシェルから取り外すには、開いた窓に向かってエッジを転がして、シェルの破片を引き離さないようにします。卵が生存可能で健康であることを確認してください。理想的な卵はそれから枝分かれ小さい容器が開いた区域の中心に大きい容器を有する。
4. 湾曲したアイリス鉗子を使用して、理想的には分岐点の上に、血管の上にCAM上に無菌、ノンスティックリングを置きます。滅菌ガラスの攪拌ロッドを使用して、CAMを穏やかにアブレイドします。
5. ステップ3.6からノンスティックリングの中心に細胞懸濁液をピペットする。あるいは、ステップ4.2からノンスティックリングの中心に腫瘍片を配置し、ステップ4.1で生成された細胞外マトリックス溶液の20〜50μLで覆うために鉗子を使用する。
6. 開口を6×7cm透明フィルムドレッシングの4分の1の部分で密封します。適切なインプラント指定で卵にラベルを付けます。
   注:グループ内の卵の番号付けは、縦方向の観察を容易にします。
7. 卵をインキュベーターに戻します。シェルの開口部が直立し、卵が安全であることを確認します。
   注:卵は回転せずに卵インキュベーターに戻すことができます。あるいは、CO ₂ を非活性化させた37-38°Cの細胞インキュベーターと湿度を監視する湿度を用いて高い移植後生存率を得ることができ、これは50%〜80%であるべきである。

6. ノンスティックリングなしの移植(オプション2)

注:CAMが完全に開発されている場合、細胞は開発7日目から移植することができます。移植は、腫瘍の発生と所望の実験のための十分な時間を可能にする孵化の前にいつでも起こり得るが、胚の免疫細胞が10日目の受精後 ²⁷ の周りに存在し始めることに注意してください。この方法は、腎細胞癌細胞および膀胱癌細胞を移植するために使用した。

1. 70%エタノールを使用してバイオセーフティキャビネットと必要なすべてのツールを消毒します:適切な容積のピペットとチップ、無菌10cmのティッシュ培養皿、卵ラック、6 x 7 cm透明フィルムドレッシング、オフィスハサミ、およびマーカー。
2. ステップ3.6で生成した細胞懸濁液の接種量を適切なサイズのピペットチップ(200μLが典型的)に吸引する。先端の上部を保持しながら、慎重にピペットの先端を排出し、無菌、10cmの組織培養皿に水平に配置します。
3. グループ内のすべてのサンプルについて、ステップ 6.2 を繰り返し、各グループに 1 つの皿を含めます。
4. 37°Cのインキュベーターにチップを15~30分間入れ、細胞外マトリックスを部分的に重合させます。
5. 15分のインキュベーション後、重合の確認を開始します。少量の液体は、通常、皿の上に置くと先端から漏れます。この液体の重合は、先端内の液体の重合の程度を推定するために使用することができる。
6. バイオセーフティキャビネットの卵ラックに埋め込む卵を置きます。管理可能な卵の数を選択します。最大6が典型的です。卵を一緒に作業しながら、卵が実質的に冷却することを避けてください。
7. 開いた窓に向かってエッジを転がして、透明フィルムドレッシングをシェルから取り外します。これにより、シェルの破片を引き離すのを避けます。
8. 卵が生存可能で健康であることを確認してください。理想的な卵はそれから枝分かれ小さい容器が開いた区域の中心に大きい容器を有する。
9. 適切なサイズのピペットにピペットチップを1つ置きます。プランジャーを押し下げ、部分的に重合された細胞懸濁液を、理想的には分岐点上の大きな、よく発達した容器の上にCAMに押し込む。
10. 開口を6×7cm透明フィルムドレッシングの4分の1の部分で密封します。
11. 適切なインプラント指定で卵にラベルを付けます。
    注:グループ内の卵の番号付けは、縦方向の観察を容易にします。
12. 卵をインキュベーターに戻します。シェルの開口部が直立し、卵が安全であることを確認します。
    注:卵は回転なしで専用の卵インキュベーターに戻すことができます。あるいは、CO ₂ を非活性化させた37-38°Cの細胞インキュベーターと湿度を監視する湿度を用いて高い移植後生存率を得ることができ、これは50%〜80%であるべきである。

ホタルルシメラーゼの生物発光イメージングは腫瘍を示す

注:移植された細胞がホタルルシフェラーゼまたは他のイメージング因子をコードする遺伝子で安定に導入された場合、得られた腫瘍は、生物発光イメージングを使用して視覚化され得る。卵殻からの背景が高いため、無傷の卵には蛍光イメージングは推奨されません。シェルの開口部が生存率を大幅に低下させるので、これは終点解析です。腫瘍は、実験のニーズおよび腫瘍の成長の速度に適した任意の時点で画像化され得る。しかし、平均して、卵は21日後に孵化する。したがって、開発日18は、不要なハッチングを回避するための適切なエンドポイントである。

1. 必要に応じて、卵をイメージング施設に運ぶ。10cmのティッシュ培養料理にテープ卵。回転機構を取り外したり、非アクティブ化して、卵インキュベーターを37.8°C(100°F)に戻します。湿度は、輸送やイメージングのために重要ではありません。
2. 湾曲したアイリス鉗子を使用して、CAMがアルブミンと胚と一緒に洗い流されるまで、CAMをシェルからそっと押し出します。広い先端の標本の鉗子を使用して、腫瘍の視覚化のために十分に貝の開口を拡大するために貝の部分を壊す。
3. 卵アルブミンに最低50μLの30mg/mL D-ルシフェリンを注入します。同様のD-ルシフェリンの体積は、移植された細胞を含む領域の非スティックリングまたはCAMの表面にピペトされてもよい。これは理想的な管の供給の不在の最適生物発光を保障する。8分間インキュベートします。
4. 卵を麻酔するために卵のアルブミンにイソファフルランの20-50 μLを注入します。さらに2分間インキュベートする代わりに、卵を2〜2.5%気化イソファフルランを含む誘導室に入れてもよい。胚の動きが止まるときに適切な麻酔深度が得られる。
   注:イソファフルラン(100μL)の大きなボリュームは、卵を安楽死させるために使用することができます。
5. 卵を生物発光イメージングデバイスに入れ、メーカーの指示に従って適切な設定を使用して画像を撮ります。本研究では、1分間の露光時間を用いた。
6. 残りのCAMおよび胚を画像化するために、卵を10cmの組織培養皿に開けた。
   1. 卵の真ん中近くの卵の下側に両手の指で卵をつかみ、殻の開口部の両側の親指を持ちます。
   2. 親指で卵の2つの半分をそっと引き離し、指で卵にそっと押し込みます。
   3. シェルがCAMと胚から約半分分離されたら、10cmの組織培養皿の上に卵をひっくり返す。
   4. シェルの半分を分離し続けます。シェルの内側に CAM が付いている場合は、指を使用してシェルから CAM を押し出します。
   5. 胚は、必要に応じて別の皿に反転され得る。
   6. 必要に応じて、追加のイソファフルランは、ステップ7.4のように投与され得る。

   8. 腫瘍の収穫

   注:腫瘍は、実験のニーズと腫瘍の成長の速度に適したいつでも収穫することができます。しかし、平均して、卵は21日後に孵化する。したがって、開発日18は、不要なハッチングを回避するための適切なエンドポイントである。

   1. 鉗子で腫瘍をつかむ。ハサミ(春の虹彩はさみはよく働く)またはメスを使用して、慎重にCAMから腫瘍を切除します。
   2. もし腫瘍がホタルルシファーゼ遺伝子で導入された場合、再イメージングを行って、可視化が困難な腫瘍の除去が成功したことを検証してもよい。
      注:切除された腫瘍は、特定の実験に適した任意の方法によって分析され得る。腫瘍はまた、CAMまたはマウスに再移植され得る。腫瘍同一性を確認するために、腫瘍を固定し、パラフィンを埋め込み、ヘマトキシリンおよびエオシンまたは免疫組織化学的染色で検査することができる。

これまでのところ、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌癌および膀胱癌に対してこの移植方法が成功することを発見した。各々は、柔軟性があるかもしれないが、移植のための特定の条件を識別するために最適化された。検査された腫瘍タイプのうち、卵巣癌の増殖は、生物発光イメージングの助けを借りずに顕著で、典型的には見えない( 図1)。 しかし、CAMの硬化は、移植領域の鉗子で感じることができました。これは、生物発光イメージングの不在時に可能な腫瘍増殖を同定するのに役立つ可能性があるが、組織学または別の適切な方法を介してさらなる検証が必要であろう。ヒトとマウスの両方の細胞株の生着に成功し、他のin vivoモデルに見られる形態と一致する形態を示す( 図1A および 1B)。 また、腫瘍片の移植が可能であった( 図 1C、 青矢印は腫瘍を示す)。この場合の移植された腫瘍は、高等級、転移性、卵巣漿液性癌の患者から来た。結果として生じる腫瘍は、形態的に起源の腫瘍に似ており、CAMおよび鶏胚組織からの分化を容易に可能にするサイトケラチン8/18のようなヒト特異的タンパク質を発現させた。