Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware

Introduction

理解分子世界的表征对于成为生物分子科学专家 ^{至关重要1，} 因为对这些图像的解释是理解生物学功能 ² 的关键。学习者对大分子的介绍通常以细胞膜，细胞器，大分子等的二维教科书图像的形式出现，但生物学现实是这些是三维结构，了解它们的属性需要从3D模型中可视化和提取意义的方法。

因此，生物分子视觉素养在高年级分子生命科学课程中的发展受到关注，多篇文章报道了可视化技能教学的重要性和难点1、3、4、5、6、7、8、9 ^{^{^{^{^{^{^{^{^{^{^{^{^{^{^{.对这些文章的回应是课堂干预的数量增加，通常在单个机构的一个学期内，其中分子可视化程序和模型用于针对困难的概念
^{2，10，11，12，13，14，15}
^{^{^{^{^{^{^{^{^{^{^{^{.此外，研究人员试图描述学生如何使用生物分子可视化程序和/或模型来处理特定主题16，17，18，19。
^{^{^{^{^{^{^{我们自己的小组BioMolViz描述了一个框架，该框架将视觉素养的总体主题细分为学习目标和目的，以指导此类干预措施
^20，21，
并且我们领导研讨会，培训教师在评估的逆向设计中使用该框架来衡量视觉素养技能
^{^{^22。}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}

所有这些工作的核心是一项关键技能：使用生物分子可视化程序操纵大分子结构的能力。这些工具是使用各种平台独立开发的;因此，它们在操作和使用方面可能相当独特。这需要特定于程序的说明，并且标识用户熟悉的程序对于促进持续实现非常重要。

除了在3D中操纵结构（旋转，选择和改变模型）的基本知识之外，一个主要目标是对蛋白质的活性位点进行建模。该过程允许学习者在BioMolViz框架描述的三个总体主题中发展他们的理解：分子相互作用，配体/修饰和结构 - 功能关系 ^20，21。

生物分子可视化的四种流行程序选择包括：Jmol/ JSmol ^23，iCn3D ^24，PyMOL ²⁵ 和UCSF Chimera ^26，27。 ^{^{我们鼓励那些刚接触Chimera的人使用UCSF ChimeraX，这是Chimera分子可视化程序的下一代，这是该程序目前支持的版本。}}

在该协议中，我们演示了如何使用这四个程序中的每一个来模拟具有结合底物类似物复合物（PDB ID：3FGU）的人葡萄糖激酶的活性位点，并显示测量结果以说明特定的结合相互作用 ^28。该模型代表了酶的催化复合物。为了捕获预催化状态下的活性位点，将ATP的不可水解类似物结合到葡萄糖激酶活性位点。这种磷酸氨基膦酸腺苷酸酯（ANP）在此位置含有磷 - 氮键，而不是通常的磷氧键。活性位点还含有葡萄糖（在模型中表示为BCG）和镁（表示MG）。此外，在结构中存在钾离子（K），由结晶溶剂中使用的氯化钾产生。这种离子对生物功能并不重要，并且位于活性位点之外。

图 1：ATP/ANP结构。 三磷酸腺苷（ATP）结构与磷酸氨基膦酸腺苷酸酯（ANP）相比。请点击此处查看此图的放大版本。

该协议证明了底物类似物复合物的结合配体的选择以及结合复合物5 Å内活性位点残基的鉴定，其捕获能够进行相关分子相互作用的氨基酸和水分子，包括疏水性和范德华相互作用。

显示器最初纵以卡通表示显示大部分蛋白质，活性位点氨基酸残基在棒表示中以显示蛋白质的相关原子并突出显示分子相互作用。在每个程序的方案的步骤3之后，已经应用了这些表示，并且蛋白质的视图在程序之间是相似的（ 图2）。 在方案结束时，蛋白质卡通被隐藏以简化视图，并专注于活性位点。

图2： 跨程序的结构比较。 在调整表示步骤（每个协议的步骤2或3）之后，比较每个程序中3FGU的结构。请点击此处查看此图的放大版本。

CPK着色剂应用于活性位点氨基酸和结合配体 ^29，30。 ^{^{这种着色方案区分了线，棒，球和棍子以及空间填充表示中所示的分子模型中不同化学元素的原子。在CPK着色方案中，氢是白色的，氮是蓝色的，氧气是红色的，硫是黄色的，磷是橙色的。传统上，黑色用于碳，尽管在现代使用中，碳着色可能会有所不同。}}

氢原子在晶体结构中不可见，尽管这些程序中的每一个都能够预测它们的位置。将氢原子添加到大分子结构中可能会遮挡视图，因此它们不会显示在此协议中。因此，通过从这些结构中的两个杂原子（例如，氧到氧，氧到氮）的中心进行测量来显示氢键。

计划概述
可下载的图形用户界面（GUI）： PyMOL（版本 2.4.1）、ChimeraX（版本 1.2.5）和 Jmol（版本 1.8.0_301）是基于 GUI 的分子建模工具。这三个接口具有用于输入类型化代码的命令行;许多相同的功能可通过 GUI 中的菜单和按钮获得。这些程序的命令行中的一个常见功能是，用户可以使用键盘上的向上和向下箭头键加载和重新执行以前的命令。

基于 Web 的 GUI：iCn3D（I-see-in-3D）是基于 WebGL 的查看器，用于在 Web 上交互式查看三维大分子结构和化学物质，而无需安装单独的应用程序。它不使用命令行，尽管完整 Web 版本具有可编辑的命令日志。JSmol是Jmol的JavaScript或HTML5版本，用于网站或Web浏览器窗口，并且在操作上与Jmol非常相似。JSmol可用于创建在线教程，包括动画。

Proteopedia ^31， ^{^32，
FirstGlance in Jmol
^33，
和密尔沃基工程学院生物分子建模中心的JSmol Web界面（JUDE）就是这种基于Jmol的在线设计环境的例子
³⁴
.Proteopedia wiki是一个教学工具，允许用户对大分子结构进行建模，并在网站
³⁵
中创建具有这些模型的页面。使用 JSmol 构建的 Proteopedia 场景创作工具将 GUI 与 Jmol GUI 中不可用的其他功能集成在一起。}

Jmol和iCn3D基于Java编程语言;JSmol使用Java或HTML5，PyMOL和ChimeraX基于Python编程语言。这些程序中的每一个都加载蛋白质数据库文件，这些文件可以从RCSB蛋白质数据库下载，分辨率为4位字母数字PDB ID ^36，37。 ^{^{最常见的文件类型是蛋白质数据库（PDB）包含.pdb扩展名的文件和包含 .cif 扩展名的晶体信息文件（CIF 或 mmCIF）。CIF 已取代 PDB 作为蛋白质数据库的默认文件类型，但这两种文件格式在这些程序中都起作用。使用CIF与PDB文件相比，序列/结构的显示方式可能会略有不同;但是，文件的功能类似，此处不会详细介绍差异。分子建模数据库（MMDB）是美国国家生物技术信息中心（NCBI）的产品，是分类信息（例如，生物学特征，保守蛋白质结构域）相关的PDB结构的子集
^38。
iCn3D是NCBI的产品，能够加载包含MMDB数据的PDB文件。}}

要查看模型，用户可以从结构的专用蛋白质数据库页面下载所需的文件（例如，https://www.rcsb.org/structure/3FGU），然后使用程序的下拉 "文件 "菜单打开结构。所有程序还能够通过接口直接加载结构文件，并且该方法在协议中进行了详细说明。

ChimeraX、Jmol 和 PyMOL GUI 都包含一个或多个控制台窗口，可以通过拖动角来调整大小。iCn3D和JSmol完全包含在Web浏览器中。使用 iCn3D 时，用户可能需要在弹出窗口中滚动以显示所有菜单项，具体取决于屏幕大小和分辨率。

这里详述的实验方案提供了一种使用每个程序显示酶活性位点的简单方法。应该注意的是，有多种方法可以执行每个程序中的步骤。例如，在 ChimeraX 中，可以使用下拉菜单、顶部工具栏或命令行执行相同的任务。鼓励有兴趣详细了解特定程序的用户浏览这些程序可用的在线教程，手册和Wiki 39，40，41，42，43，44，45，46。

这些程序的现有手册和教程将此协议中的项目呈现为离散任务。若要显示活动站点，用户必须从各种手册和教程中合成所需的操作。本手稿通过提供用于使用分子相互作用对标记的活动位点进行建模的线性协议来补充现有的教程，为用户提供可应用于其他模型和程序的活动位点建模逻辑。

图 3：ChimeraX GUI。 ChimeraX GUI 界面，其中标有下拉菜单、工具栏、结构查看器和命令行。请点击此处查看此图的放大版本。

图 4 ：iCn3D GUI. iCn3D GUI 界面，带有下拉菜单、工具栏、结构查看器、命令日志、选择集弹出窗口以及序列和注释弹出式菜单。请点击此处查看此图的放大版本。

图 5：Jmol GUI。 Jmol GUI 界面，其中标有下拉菜单、工具栏、结构查看器、弹出菜单和控制台/命令行。请点击此处查看此图的放大版本。

图 6：PyMOL GUI。 PyMOL GUI 界面，带有下拉菜单、结构查看器、名称/对象面板、鼠标控制菜单和标有命令行的标签。请点击此处查看此图的放大版本。

Protocol

注意：每个程序的协议分为十个总体步骤，（1）将结构加载到程序中，（2）识别活性位点中的配体，（3）调整表示，（4）选择5 Å内的残基以定义活性位点，（5）显示酶与活性位点配体的相互作用，（6）将侧链显示为棒并显示/调整活性位点水分子，（7）简化结构，（8）标记配体和氢键侧链，（9）保存渲染在任何时候返回工作或与他人共享，（10）保存图像以进行嵌入或打印。每个协议的步骤1，4和7-10是相同的;但是，由于每个程序的独特操作，当步骤2/3和5/6互换时，某些协议的执行效率更高。

1. 加州大学旧金山分校ChimeraX协议

注：触控板和鼠标控制。要旋转，请单击并拖动或使用双指拖动（鼠标：左键单击并拖动）。要缩放，请收缩和展开（Mac）或控制 + 双指移动（PC）（鼠标：滚轮）。要翻译（即移动整个结构），请按选项+单击并拖动（Mac）或Shift+单击并拖动（PC）（鼠标：右键单击并拖动）。要重新居中，请使用界面顶部的下拉菜单单击 操作 > 查看 。

将结构加载到 ChimeraX 中：在 GUI 底部的命令行中，前面是"命令："，键入：
打开 3fgu
注意：输入任何键入的行命令后，按键盘上的 return 键执行它。

识别活动位点中的配体：确保有两个表示，一个卡通丝带和棍子。使用鼠标旋转/缩放蛋白质，以最好地可视化蛋白质中心附近显示的配体，这些配体显示为棒状。将鼠标悬停在配体上以显示其名称。

调整表示：使用下面子步骤中的命令对蛋白质和配体进行重新着色，将 CPK 着色应用于非碳原子，然后取消选择所选内容。分子的选定部分以绿色突出显示。

使用界面顶部的下拉菜单更改颜色：单击 "操作">颜色>矢车菊蓝 "。然后，单击 "选择>配体>结构 "。要选择颜色，请单击 "操作>颜色>灰色 "。要应用 CPK 着色，请单击" 全选>"， 然后单击" 操作>异质>颜色 "。最后，通过单击" 选择">清除"来清除所选内容 。
注意：也可以通过按 Control 并在结构查看器的黑色背景中单击来清除所选内容，也可以通过键入： ~select 在命令行中清除选择。默认情况下，对于大多数包含1-4条链的结构，ChimeraX将自动显示配体和离子3.6 Å范围内的水分子和氨基酸残基。

使用下拉菜单隐藏当前显示的原子，方法是单击" 操作">"原子/键">"隐藏"。

使用下拉菜单显示活性位点中的配体和Mg离子，方法是单击 选择>结构 >配体 。然后，单击" 原子/键>>显示"的操作 。接下来，单击 "选择>残基>MG"， 然后单击" 原子/键>显示>作用"。 要清除所选内容，请单击 "选择>清除"。
注意：使用下拉菜单进行选择后，可以通过单击" 原子 "工具栏中的" 隐藏" 和" 显示 "按钮来执行步骤 1.3.3。

选择5 Å内的残基以定义活性位点：在结构查看器中，要选择配体，请按控制+移位，然后用鼠标单击三个配体（即 BCG，ANP 和 Mg） 中的任何单个原子或键。

接下来，按键盘上的向上箭头键，直到三个配体的所有原子都以绿色光芒突出显示。定义此选择以供将来使用，方法是单击下拉菜单中 的"选择>定义选择器 "。在弹出式菜单中，键入：
配体以命名当前选择，然后单击确定。
注意：在步骤 1.4.1 中单击向上箭头太多次将选择整个蛋白质。在这种情况下，单击向下箭头按钮，直到仅选择了三个配体的原子。

使用下拉菜单选择配体5 Å内的残基：单击 选择>区 。在出现的弹出窗口中，将"选择"下拉菜单切换为" 残留"， 并确保选中顶部框（选中小于（确定。只有距离小于 5 Å 的残留物才会突出显示。
注意：使用命令行可以广泛简化步骤 1.4-1.4.2，方法是键入：
名称冷冻配体：BGC：MG：ANP
选择区域配体 5 扩展真残基真

将侧链显示为棒并显示/调整活动位点水分子：使用下拉菜单显示选择，并通过单击 "原子/键>显示>操作 来居中和缩放选择。要使所选内容居中，请单击" 操作">"视图"。 然后，要清除选择，请单击 "选择>清除 "或单击空白区域中的任意位置。

显示酶与活性位点配体的相互作用：使用下拉菜单，然后单击 "选择>用户定义的选择器>配体 。然后，单击" 工具>结构分析>H键 " 。在弹出窗口中，确保选中 "按选择限制 "，下拉菜单设置为"至少选择了一个末端"，并选中 "选择原子"， 然后单击" 确定 "。要清除所选内容，请单击 "选择>清除"。
注：选中 "距离标签 "框以查看以Å为单位的粘合长度。但是，这使得视图非常繁忙。最后，您可以通过单击"颜色"框并在弹出窗口中选择新颜色来更改 H 键的颜色。

简化结构：使用顶部卡通工具栏隐藏卡通或单击下拉菜单： 操作>卡通>隐藏 。

标记配体和氢键侧链：使用鼠标选择与配体氢键合的残基（由虚线连接），如步骤1.4所示。然后，在下拉菜单中，单击 "操作">"标签>残留物>名称组合 "。接下来，单击 "选择>配体>用户定义的选择器 "。然后，单击" 标记>残留>关闭>操作"。 最后，通过单击" 选择">清除"来清除所选内容 。

随时保存渲染以返回工作或与他人共享：在下拉菜单中单击" 文件">保存 "。选择一个位置，输入文件名，然后单击保存。
注意：确保格式设置为：ChimeraX 会话 *.cxs。

保存图像以进行嵌入或打印：首先使用鼠标根据需要定向分子。通过在命令行中键入内容将背景色更改为白色：
设置 bg颜色白色
最后，单击工具栏中的 快照图标 。图像将保存到桌面。
注意：背景颜色在下拉菜单中也可用;在Mac上，单击 UCSF ChimeraX>首选项 ;在PC上，单击" 收藏夹">"设置>背景"。

2. iCn3D协议

注： 触控板和鼠标控制 ：旋转、单击和拖动（鼠标：左键单击并拖动）。要缩放，请收缩和展开（鼠标：旋转滚轮）。要翻译（即移动整个结构），请单击并用两根手指拖动（鼠标：右键单击并拖动）。要重新居中，请将鼠标悬停在顶部下拉菜单中的"视图"上，然后单击" 中心选择"。

将结构加载到 iCn3D 中：导航到 iCn3D 基于 Web 的 3D 结构查看器，然后在 "输入 MMDB 或 PDB ID" 框中键入 3FGU 以加载文件。

识别活动站点中的配体：将鼠标悬停在下拉菜单中的"分析"上，然后单击" 序列和注释"。 序列，在本例中为蛋白质和化学/离子/水，显示在堆叠表中。向下滚动以查看列出的活性位点配体 ANP、BGC 和 Mg。在结构查看器中，将鼠标悬停在活动位点中的配体上（在蛋白质卡通的中心显示为棍子）以查看它们的名称。

调整表示形式：此协议不需要进行初始调整。

选择 5 Å 内的残基以定义活动位点：要选择配体，请使用选择下拉菜单，然后单击 在 3D 上选择 。确保选中 "残留物 "。

要选择配体，请按住 PC 上的 ALT 按钮或 Mac 上的"选项"按钮，然后使用鼠标或触控板单击第一个配体（例如 BCG）。 然后，按 Control 键并单击 ANP 和 MG 配体以将它们添加到选择中。
注意：配体在被选中时将以黄色突出显示。

使用下拉菜单保存此选择：单击 "选择">保存选择"， 然后使用键盘在弹出窗口中输入名称（例如 ，3Ligands）， 然后单击" 保存"。 现在将出现"选择集"弹出窗口。
注意：如果选择不正确，请单击 "选择>清除选择"。

选择配体 5 Å 范围内的残基：在下拉菜单中，单击 "按距离选择>"。 在出现的弹出菜单中，通过键入块，将第二个项目（带半径的球体）更改为 5 Å。单击框内单词 "显示 "，然后单击右上角的十字号以关闭窗口。
注意：在步骤 2.4.3 中出现的弹出菜单中，将第一组输入保留为"已选择"，第二组保留为"未选定"。请注意，单击" 显示 "时，5 Å 内的原子/结构将高亮显示并发出黄色光芒。

使用下拉菜单保存5 Å活动站点：将鼠标悬停在"选择"上，然后单击" 保存选择"， 使用键盘在弹出窗口中输入名称（例如 ，5Ang）， 然后单击" 保存"。

接下来，创建一个组合两组（5Ang 和 3 配体）的新选区：在 "选择集" 弹出式菜单中，按住 Ctrl 键单击（PC）或命令单击（Mac） 5Ang 和 3 配体 。单击 "选择>保存选择 "，使用键盘键入名称（例如 ，5AFull）， 然后单击" 保存"。

显示酶与活性位点配体（如氢键）的相互作用：将鼠标悬停在下拉菜单中的分析上，然后单击 相互作用 。将出现一个包含所有非等效交互的综合弹出菜单。

取消选中除"氢键"和"盐桥/离子"复选框之外的所有内容。单击 "3配体 "以选择第一组，单击 "5Ang" 以选择第二组。单击显示 "3D 显示交互"的 框内文本。通过单击右上角的十字标志关闭窗口。
注：接触/相互作用可能代表感应偶极子诱导偶极子相互作用，这通常会使显示器繁忙。如果需要，可以更改任何类型交互的距离。

要仅显示氢键，请单击"选择集"弹出窗口中的 "5Afull"。 然后，将鼠标悬停在下拉菜单中的"分析"上，然后单击 "Chem.绑定>显示 "。

将侧链显示为棒并显示/调整活动位点水分子：使用选择集弹出菜单，然后单击 5AFull 。然后，在下拉菜单中，单击样式 > 侧链 > 棍子 。要应用 CPK 着色，请单击" 原子颜色>"。 最后，单击样式 >水>球体 （如果您更喜欢较大的水分子）。

简化结构：在"选择集"弹出菜单中，单击 "5AFull"。 然后，在下拉菜单中，单击" 查看>查看选择 "（仅查看 5AFull 绑定站点）。接下来，单击" 样式>蛋白质>棒 "（将蛋白质链显示为棒状而不是色带）。

要将配体的碳原子着色为对比色，请单击" 选择集" 弹出窗口中的" 化学品 "。然后，在下拉菜单中，单击 查看> 查看选择 。接下来单击 "选择>3D选择"（ 确保选中"原子"）。使用步骤2.4.1中描述的控件，使用鼠标和键盘选择BGC和ANP中的所有碳原子。然后，在下拉菜单中单击 "颜色>单色>青色>青色 " 。

要重新显示整个活动站点，请使用 "选择集" 弹出窗口单击 "5AFull"。 然后，在下拉菜单中，单击" 查看>查看选择"。

标记配体和氢键侧链：使用"选择集"弹出窗口选择 Interface_all， 然后在下拉菜单中单击" 分析>"标签>每个残留物和数量 "。
注意：每次要添加标签时，您都必须重新选择"每残留物和数字"，即使菜单项已从以前的标签中选中。

随时保存渲染以返回工作或与他人共享：在下拉菜单中，单击" 文件">"共享 链接"。复制短 URL（例如：https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/icn3d/share.html?r83NqCz41bu7cmcs8）并将其粘贴到浏览器上。

保存图像以进行嵌入或打印：在下拉菜单中，单击 "选择>切换突出显示 "。然后，单击 "样式>背景>白色 "。最后，单击" 文件">"将文件保存>iCn3D PNG图像"， 然后选择所需的大小。

3. Jmol协议

注：触控板和鼠标控制：要旋转，请点按并拖动（鼠标：左键点按并拖动）。缩放：使用两根手指垂直滚动（鼠标：按住 Shift + 左键单击 + 垂直拖动）。要翻译（即移动整个结构）控件 + alt + 单击并拖动（PC），控制 + 选项 + 单击并拖动（Mac）。要重新居中：shift + 在结构查看器窗口的空白处双击。

将结构加载到 Jmol 中：使用 GUI 顶部的下拉菜单，通过单击" 文件">控制台 "来设置具有该结构的工作空间。然后，单击" 文件>获取PDB"。 在弹出窗口中，键入 ：3fgu
然后，单击确定。
注意：或者，使用 Jmol 控制台加载结构，方法是键入 ：load = 3fgu
注意：输入任何键入的行命令后，按键盘上的 return 键执行它。

调整表示形式：通过右键单击（或按住 Control 并单击 ）"结构查看器"窗口中 的任意位置来打开弹出菜单。

要将蛋白质更改为卡通表示，请在弹出菜单中，单击 "选择>选择光晕 "。接下来，单击 "全选>蛋白质>"。 最后，点击 样式>方案 > 卡通 。
注：选择光晕会在所有选定的原子周围放置一个黄色轮廓（发光）。

使用顶部下拉菜单隐藏水，方法是单击" 显示>选择>水 "。接下来，单击" 显示>原子>无 "，最后单击" 显示">"选择>无 "。

识别活动位点中的配体：使用鼠标放大活动位点，然后使用子步骤中的命令将配体显示为棒状。
注意：加载文件时，配体名称将显示在 Jmol 控制台中。您还可以使用弹出式菜单查看绑定的配体名称，方法是单击 "选择hetaTM>>异种 "。

用鼠标将鼠标悬停在配体上以查看其名称。活动地点靠近结构的中心;配体MG，BGC和ANP位于活性位点。

选择配体 BCG 和 ANP：使用 Jmol 控制台，键入：
选择 BGC、ANP

要将配体 BCG 和 ANP 显示为棒状，请使用弹出式菜单，然后单击 样式 > 方案 > 棒 。

选择 5 Å 内的残基以定义活动位点：在 Jmol 控制台中，键入以下命令以选择三个配体的 5 Å 内的原子：
在（5，（bgc，anp，mg））

要选择完整的氨基酸残基，请在控制台中键入以下内容，然后按 Enter
选择在（组，已选）
注：Jmol 控制台是选择 5 Å 内残留物的最佳方式。

将侧链显示为棍子并显示/调整活动部位的水分子：右键单击以显示弹出菜单，然后将鼠标悬停在 "样式>方案">棒 "上。
注意：步骤 3.5 以棒表示形式显示活动站点侧链。结构中仍然会有一些空的光晕，代表活性位点中的水分子。

在 Jmol 控制台中，重新执行以下命令：
在（5，（bgc，anp，mg））
注意：要重新执行命令，请在控制台中单击，然后使用键盘上的箭头键，直到出现该命令，然后单击 Enter 以重新执行该命令。

要显示水分子原子，请通过键入以下两个命令从选择中删除配体和蛋白质：
选择去除组蛋白
选择删除组异质而不是水

要显示水分子，请单击下拉菜单显示。将鼠标悬停在Atom上，然后单击 20%范德华 。绿色的镁离子仍将显示为棒状。通过在 Jmol 控制台中键入以下命令，在更常见的球体表示中显示镁离子：
选择毫克
空间填充 50%

重新着色配体以将其与蛋白质区分开来：在Jmol控制台中，键入以下内容以执行以较浅的配色方案重新着色配体的命令：
选择（bgc，anp）和碳;颜色 [211，211，211]
选择（bgc，anp）和氧气;颜色 [255，185，185]
选择（bgc，anp）和氮气;颜色 [150，210，255]
选择（bgc，anp）和磷;颜色 [255，165，75]
选择毫克;颜色淡绿色

显示酶与活性位点配体的相互作用：使用Jmol控制台，执行以下命令的每一行：
定义利宾德（ANP，BGC，MG）
在（5，（bgc，anp，mg））
选择删除组异质而不是水

要显示线条来说明氢键，请在 Jmol 控制台中键入以下命令：
连接 3.3 （木质素和（氧气或氮气））（选择和（氧气或氮气））支柱黄色
然后，通过在控制台中键入以下命令来修改线条的粗细：
全选;支柱 0.1;选择无

简化结构：要隐藏蛋白质的卡通并清除选择，请在Jmol控制台中键入：
全选;卡通关闭;选择无

标记配体和氢键侧链：在弹出窗口中，单击" 设置拾取>选择原子 "。单击其中一个氢键残基中的原子。氨基酸和残基编号显示在控制台中。然后，使用控制台键入标签，例如：
标签 Glu-256

随时保存渲染以返回工作或与他人共享：在顶部菜单中，单击相机图标。键入文件名并选择要保存的位置。
注：导出的 JPEG 文件（.jpg）包含导出时图像在显示窗口中显示的信息，以及模型的当前状态。要重新加载模型，请打开 Jmol 并将保存的 JPEG 文件拖动到 Jmol 显示窗口中。

保存图像以进行嵌入或打印：在 Jmol 控制台中，通过键入以下内容将背景重新着色为白色：
背景白色
与步骤3.9一样，单击相机图标并保存文件。

4. PyMOL协议

注：触控板和鼠标控制：要旋转，请点按并拖动（鼠标：左键点按并拖动）。缩放、收缩和展开（鼠标：右键单击并拖动）。要翻译（即移动整个结构），请控制+单击并拖动（鼠标：命令+左键单击并拖动）。要重新居中，请转到右侧的对象面板，然后单击 ">方向"或"居中"。

将结构加载到 PyMOL 中：在 GUI 顶部附近的命令行中（前面是"PyMOL>"），键入：
获取 3FGU
注意：输入任何键入的行命令后，按键盘上的 return 键执行它。

调整表示形式：在 PyMOL 窗口右侧的名称/对象面板中，在"3FGU"右侧单击 H > Waters 。

识别活动站点中的配体：首先通过单击顶部下拉菜单打开序列查看器： 显示>序列 。

向右滚动灰色条，直到找到配体名称（BCG、ANP、MG、K）。
注意：有两种表示形式，卡通丝带和棍子;配体显示为棒状。确保右下角面板上鼠标控件中的选择模式设置为 "残留和 3 按钮查看模式"， 方法是单击这些名称以切换选项。

使用鼠标旋转和缩放以使配体可见。

选择5Å内的残基以定义活性位点：要选择活性位点中的配体，请在结构查看器中单击每个配体 （BCG，ANP，MG）。 在名称/对象面板中弹出一个新选择;在这个名为"sele"的新对象的右侧，单击 A按钮， 然后单击弹出菜单中的" 重命名 "。
注：要清除不需要的选择，请单击结构查看器中的空白区域以取消选择。

使用键盘，删除出现在结构查看器窗口左上角的字母"sele"，然后键入：
配
注意：步骤4.4-4.4.1可以使用命令行完成;类型：
sele 配体，resn BGC+ANP+MG

使用此选择通过首先复制配体来定义配体周围的区域，单击配 体>>复制 " 。然后，单击 sel01>>重命名
使用键盘，删除字母"se101"，然后键入：
积极

修改此选择以显示 5 Å 内的残留物：在名称/对象面板中，单击 活动> A >修改>> 5 A，残留物 。然后，要将这些残留物显示为棒状，请单击 活性> S > 甘草>棒 。最后，在结构 查看器 中的空白处单击以清除所选内容。
注意：步骤 4.4.3 可以使用命令行完成，键入：
sele 活性，所有配体的 5 个以内
显示摇杆，活动

将侧链显示为棒状并显示/调整活性位点水分子：在名称/对象面板中，单击 配体> A >重复 。要重命名所选内容，请单击 Sel02 > 重命名所选内容>。 删除结构查看器右上角显示的重命名菜单中的字母，然后键入：
active_water

要调整新选择以包含活性位点水分子，请单击active_water > A > 修改> 4埃内>原子 周围。要进一步修改并限制为水分子，请单击 active_water > A >修改>限制>为溶剂。 最后，单击 active_water > > 预设>球和棍子 。
注：GUI允许在4 Å内进行选择;line 命令允许为氢键水分子选择更合适的 3.3 Å 距离。球体的范德华半径不能在 GUI 中设置，但"球和棍子"选择接近 0.5 Å。
注意：可以使用命令行执行步骤 4.5-4.5.1，方法是键入以下代码的每一行：
选择active_water，（配体）在3.3左右）和（resn HOH）
显示球体，active_water
改变active_water，vdw=0.5
重建

显示酶与活性位点配体的相互作用。通过单击活动>放大活动站点 > 缩放。要查找配体和活性位点之间的极性接触，请单击 配体> A > 查找>>任何原子的极性触点 。通过单击 "S >标签"ligands_polar_contacts >将 距离显示为标签。

简化结构：通过单击名称/对象面板中的 3FGU>H>卡通 来隐藏蛋白质的卡通，该卡通隐藏不在活性位点中的蛋白质部分。接下来，通过单击名称/对象面板中的 ligands_polar_contacts >H>标签 来隐藏氢键长度的标签。

要为配体着色以将其与蛋白质区分开来，请单击 配体>C>按元素>CHNOS， 然后选择"C"为青色（浅蓝色）的选项。
注意：可以使用命令行执行步骤 4.7.1。类型：
颜色青色，配体
颜色原子，配体和！elem C

标记配体和氢键侧链：在名称/对象面板中，在任何对象名称右侧的按钮上，单击 活性> L >残基 。

随时保存渲染以返回工作或与他人共享：在下拉菜单中，单击" 文件">"将会话另存为 "。然后，在弹出窗口中选择一个位置，键入文件名，然后单击保存。

保存图像以进行嵌入或打印：首先，通过单击" 显示>背景">白色 "，在下拉菜单中将背景更改为白色。将图像导出为新文件，方法是单击" 文件">将图像导出为> PNG 。

Representative Results

每个程序成功执行的实验方案将导致在活性位点上放大的分子模型，活性位点残基和配体显示为棒状，蛋白质卡通隐藏，配体以对比色方案显示。相互作用的氨基酸残基应标有其标识符，氢键和离子相互作用应用谱线显示。这些特征的存在可以通过对模型的目视检查来确定。

为了便于进行此检查，并使用户能够确定他们是否正确执行了协议的步骤，我们提供了动画图形，这些图形在每个步骤之后都显示了结构的图像。对于 ChimeraX、iCn3D、Jmol 和 PyMOL，图 7-10 分别对此进行了说明。

图 7：ChimeraX协议输出。 动画图说明了ChimeraX协议的步骤1.1-1.8。请点击此处下载此图。

图 8：iCn3D协议输出。 动画图说明了iCn3D协议的步骤2.1-2.8。请点击此处下载此图。

图 9：Jmol协议输出。 说明Jmol协议步骤3.1-3.8的动画图。请点击此处下载此图。

图 10 ：PyMOL 协议输出。 说明 PyMOL 协议步骤 4.1-4.8 的动画图。请点击此处下载此图。

可能影响这些协议结果的最常见错误是选择错误，导致部分结构显示在不需要的渲染中。这通常是由于在结构本身或其中一个显示菜单按钮中单击错误的结果。次优结果的一个例子是，在显示为棒状的活动位点之外包含残留物的模型。用户可以通过目视检查显示为粘附的残留物并确保它们靠近活性位点配体来开始分析是否发生了此错误。评估显示的残基是否在活性位点配体的5Å范围内的高级方法是使用每个程序中内置的测量工具来测量附近配体与活性位点残基之间的距离。测量工具超出了本手稿的范围;但是，我们鼓励感兴趣的用户浏览许多详细介绍此类分析的在线教程。

我们给出了一个具体的例子，说明由于在 PyMOL 中错误地单击名称/对象面板而导致的此协议的次优执行。此错误将整个蛋白质显示为棒状，而不是仅显示使用此表示的活动位点，如图 11 所示。

图11： 阴性结果。 阴性结果的示例。在 PyMOL 中错误地选择了完整的卡通并显示摇杆。请点击此处查看此图的放大版本。

要进行故障排除，用户需要隐藏整个模型的摇杆（在名称/对象面板中标记为3FGU），然后使用PyMOL中的隐藏和显示按钮/命令，仅显示名为"active"的选择的摇杆表示形式。一旦用户能够为模型的不同部分创建适当的选择并有效地显示和隐藏它们，从这种类型的错误中恢复模型就相对简单。很容易重新启动协议并再次完成这些步骤;但是，我们鼓励用户不要害怕"脱离脚本"并尝试模型。根据我们的经验，解决显示错误有助于在理解建模程序方面取得进展。

并排显示每个程序成功执行的协议的最终输出如图 12 所示。视图的方向类似，以允许用户比较在不同程序中创建的模型的外观。

图12： 跨程序的最终结构比较。 比较协议末尾每个活动站点呈现的结构。A： ChimeraX， B： iCn3D， C： Jmol， D： PyMOL.PyMOL活性位点标签包括所有活性位点残基和配体。其他输出仅标有氢键侧链。请点击此处查看此图的放大版本。

Discussion

该协议概述了酶活性位点建模的十步过程，应用于四种流行的生物分子建模程序。该协议的关键步骤是：鉴定活性位点中的配体，选择5 Å内的残基以定义活性位点，并显示酶与活性位点配体的相互作用。区分与生物学功能相关的配体至关重要，因为这允许用户定义5 Å内的氨基酸残基，这些氨基酸残基可以在结合配体中发挥作用。最后，使用该程序显示分子相互作用允许用户发展理解促进结合的分子相互作用所需的技能。

基于计算机的分子建模协议的一个局限性是对特定命令和语法的依赖。虽然生化方案可以容忍程序的微小变化，但如果程序不严格遵守，基于计算机的研究可能会产生截然不同的最终产品。当使用命令行界面时，这一点尤其重要，因为命令行界面需要特定于程序的语法来实现特定的输出，并且标点符号或大小写的看似微不足道的更改可能会导致命令失败。每个程序都有各种Wiki和手册，用户可以在其中查找和排除命令行输入的故障;用户应特别注意命令语法的细节。尽管大多数分子可视化程序都包含撤消命令，但由于接口的复杂性，撤消命令并不总是忠实地反转最后一个执行的步骤。因此，通常鼓励保存当前工作状态，特别是对于新用户。

用于创建模型本身的数据可能会产生进一步的限制。虽然蛋白质数据库固有的标准确保了一定程度的一致性，但分子可视化程序的用户在蛋白质渲染中经常会遇到意想不到的效果。首先，大多数结构是使用X射线晶体学确定的，它提供了蛋白质的单一模型;然而，NMR结构通常由多个模型组成，这些模型可以一次可视化一个。其次，通过晶体学或低温电子显微镜实验确定的结构可能包含无法阐明位置的原子，并且在蛋白质的某些表示中表现为间隙。蛋白质结构可能具有侧链的交替构象，当以棒状渲染显示时，它们表现为从同一氨基酸主链中突出的两组。即使是骨架的短截面也可能具有这种替代构象，有时配体以多种结合构象叠加在活性位点中。

对于晶体结构，沉积的3D坐标包括不对称单元的所有组分，这提供了足够的信息来再现蛋白质晶体的重复单元。有时，与蛋白质的生物活性形式相比，这种结构将包含额外的蛋白质链（例如，胎儿血红蛋白突变体，PDB ID：4MQK）。相反，某些程序可能不会自动加载生物活性单元的所有链。例如，SARS-CoV2主蛋白酶（PDB ID：6Y2E）在使用ChimeraX，PyMOL和Jmol中此协议中描述的命令获取时，加载一半的生物活性二聚体（由两个蛋白质链组成）。虽然对命令的轻微修改将加载生物活性二聚体，但对于新手建模程序用户来说，这种考虑可能并不简单。可能出现的另一个问题是活性位点或底物本身的识别。晶体学实验是使用各种分子进行的，这些分子可以被建模成最终结构。例如，硫酸盐分子可以结合活性位点中的磷酸盐结合位点，或者它们可以结合与该机制无关的其他区域。这些分子可能会掩盖活性位点本身的正确识别，甚至可能向学生暗示它们是机制的一部分。

据推测，用户希望将此过程应用于其他活性/结合位点。为了在涉及分析新蛋白质活性位点的未来工作中应用该协议，用户将需要确定哪些结合配体与功能相关。一些配体与蛋白质功能无关，而是用于进行实验的溶剂或结晶条件的结果（例如，3FGU模型中存在的钾离子）。关键配体应通过查阅原始手稿来识别。通过实践和（在适用的情况下）对行命令语法的理解，用户将能够将所需建模程序的协议应用于任何酶活性位点，并对他们选择的其他大分子进行建模。

识别和分析结合的底物和配体是阐明分子机制和基于结构的药物设计工作的核心，这直接导致了疾病治疗的改善，包括获得性免疫缺陷综合征（AIDS）和COVID-19 47，48，49，50，51，52 ^{^{^{^{^{^{^{^{^{^{^{.虽然单个分子可视化程序提供不同的界面和用户体验，但大多数都提供可比较的功能。对于生物分子可视化素养的发展，重要的是，高年级的生物化学学生熟悉结构可视化和生成此类图像的工具
^{4，20，53。}
^{^{^{^{这使得学生能够超越教科书和期刊文章中对二维图像的解释，更容易地从结构数据
⁵⁴
中发展自己的假设，这将使发展中的科学家为解决未来的公共卫生问题和提高对生化过程的理解做好准备。}}}}}}}}}}}}}}}

总之，该协议详细介绍了使用四种领先的免费大分子建模程序进行活动站点建模。我们的社区BioMolViz采用非软件特定的方法来进行生物分子建模。我们特别避免了对程序功能的批评或比较，尽管对每个程序进行抽样的用户可能会发现，他们更喜欢一个程序中大分子建模的某些方面，而不是另一个程序。我们邀请读者使用BioMolViz框架，该框架详细介绍了该协议中针对的基于生物分子可视化的学习目标和目的，并通过 http://biomolviz.org 的BioMolViz社区网站探索用于教授和学习生物分子可视化的资源。

Disclosures

作者声明，他们没有与本文所述研究相关的或实质性的经济利益。

Acknowledgments

这项工作的资金由美国国家科学基金会提供：

改善本科STEM教育补助金（奖项#1712268）

本科生物教育本科生研究协调网络（1920270奖）

我们感谢韦斯特菲尔德大学的Karsten Theis博士对Jmol的有益讨论。

Materials
Company Catalog Number Comments ChimeraX (Version 1.2.5) https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/
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