该协议的目的是将MRI和PET/CT的多个功能成像参数集成到模型平均神经网络（avNNet）ML算法中。该算法预测乳腺癌骨转移大鼠模型中宏位值的生长，此时骨骼内的宏观变化尚不可见。

在巨肉生长之前，骨髓入侵传播的肿瘤细胞，俗称微米静病 ^{, 1，2。 1} 这种最初的入侵可以被认为是转移性疾病的早期步骤，但通常在常规分期检查 ^{3，4 , 期间错过} 。虽然目前可用的成像模式不能检测骨髓微创时单独使用，结合成像参数产生血管化和代谢活动的信息已被证明是效果更好 ^5。 这种互补的好处是通过将不同的成像参数组合成一个avNet，这是一个ML算法。这种 avNNet 允许在存在任何可见转移之前可靠地预测骨宏酶的形成。因此，将成像生物标志物集成到avNet中可以作为骨髓微创和早期转移性疾病的代理参数。

为了开发这个方案，在裸体大鼠中使用了先前描述的乳腺癌骨转移模型 ^{，使用了6，7，8。 , 7 , 8} 这种模式的优点是它的站点特异性，这意味着动物在右后腿只发展骨质转移。然而，这种方法的肿瘤接受率为60%~80%，因此相当多的动物在研究期间不会发展出任何转移。使用成像方式（如 MRI 和 PET/CT），从注射后第 30 天 （PI） 开始可检测到转移的存在。在较早的时间点（例如，10 PI）成像不区分动物将发展转移性疾病和那些不会（ 图1 ）。

avNNet 接受过关于第 10 天 PI 上采集的功能成像参数的训练，如以下协议所述，可可靠地预测或排除宏位值在未来 3 周内的生长。神经网络将人工节点组合在不同的层内。在研究方案中，骨髓供血和代谢活动的功能成像参数代表底层，恶性肿瘤的预测代表顶层。其他中间层包含连接到顶部层和底部层的隐藏节点。在网络训练期间更新不同节点之间的连接强度，以高精度执行各自的分类 ^任务9。 通过平均多个模型的输出，可以进一步提高这种神经网络的精度，从而产生一个 avNNet ¹⁰ 。

所有护理和实验程序都按照国家和区域动物保护立法进行，所有动物程序都得到德国弗兰科尼亚州政府的批准（参考号55.2 DMS-2532-2228）。

1. 裸体大鼠右后腿乳腺癌骨转移的诱导

注：关于裸体大鼠乳腺癌骨转移诱导的详细说明已在其他地方 ^{发表，6，8。 , 8} 下面列出了最相关的步骤。

1. 培养MDA-MB-231人类乳腺癌细胞在RPMI-1640，辅以10%的胎儿小牛血清（FCS）。保持细胞在标准条件下（37 °C，5%CO2），每周通过细胞2~3次。 ₂
2. 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中用2 mM EDTA清洗近汇的MDA-MB-231细胞，然后用0.25%的三辛分体分离细胞。使用 Neubauer 腔室确定细胞浓度，并在浓度为 1.5 x 10 ^{5 5 μL} 时在 200 μL RPMI-1640 中重新制备。
3. 使用6~8周大的裸鼠，并保持在无病原体，受控条件下（21 °C ± 2°C室温，60%湿度，12小时浅暗节奏）。提供自动清洁饲料和水广告。
4. 在做手术之前，注射镇痛药（例如，卡普罗芬4毫克/千克）皮下。以2升/分钟的流速麻醉同氟（1~1.5伏）/氧混合物的老鼠。
5. 对于手术，请使用放大倍率为 16 倍的手术显微镜。
6. 在大鼠的右侧内，执行 2~3 厘米的切口。解剖右部动脉的所有动脉，包括股骨动脉（FA）、表面的胃部动脉（SEA）、下降的天才动脉（DGA）、肺动脉（PA）和尾动脉（SA）。在 FA 上放置两个可移动剪辑：一个位于 SEA 的开始，另一个直接位于 DGA 的开头。
7. 将 SEA 的后半部分拉大。切割 SEA 的壁，并将直径为 0.3 mm 的针插入 SEA 中。将包含细胞悬浮液的注射器从步骤 1.2 连接到针头。从 FA 中卸下远点剪辑，然后夹住 SA。
8. 缓慢地将 MDA-MB-231 细胞悬浮液从步骤 1.2（1.5 x 10 ^{5 5} 细胞/200 μL）注入 SEA。取出针头，将 SEA 进行回，然后拆下动脉夹。使用手术夹关闭伤口并终止麻醉。每天监测动物，评估肿瘤大小和任何疼痛的证据。

2. 磁共振成像 （MRI）

注：有关MRI程序的详细说明，请参阅Béuerle等人 ^第11条 。

1. 使用专用实验扫描仪（参见材料表）或带适当动物线圈 的 人类 MR 系统执行 MRI 10 天 PI。
2. 用异氟兰化（1~1.5伏/氧混合物）麻醉大鼠。在老鼠的尾静脉里放置导管，然后把它用胶带固定到尾巴上。连接含有对比剂的注射器（0.1 mmol/kg Gd-DTPA，约为0.5 mL）。
3. 将麻醉大鼠放在 MR 系统中。在解剖序列中定位右后腿的侧股和近侧头骨（例如，T2加权涡轮旋转回波序列;TR = 8，654 ms;TE = 37 ms;矩阵 320 x 272;FOV = 65 毫米 x 55 毫米;切片厚度 = 1 毫米;扫描时间 11：24 分钟）。
4. 确定覆盖右后腿近侧股骨和近侧头骨的切片，并启动 DCE-MRI 序列（例如，快速低角度拍摄序列;TR = 3.9 ms;TE = 0.88 ms;矩阵 = 256 x 216;FOV = 65 x 54 mm ² ;切片厚度 = 1 毫米;8 片;100 个时间点;扫描时间 = 8：25 分钟）。30后，开始注射对比剂的时间段为10s。
   注：每只动物进行核磁共振检查的总时间约为20分钟。

3. 正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）

注：有关PET程序的详细说明，请参阅第 ^12号。

1. 使用专用实验扫描仪执行 PET/CT 成像 10 天 PI（ 参见材料表 ）。
2. 在成像前保持动物禁食。如步骤 2.2 所述，对大鼠进行麻醉，并在尾静脉中插入导管，如上所述。
3. 将 6 MBq ^{的 18} F-氟脱氧葡萄糖 ^（18 F-F-FDG） 注入尾静脉，等待约 30 分钟，使示踪剂正确分布。
4. 执行 CT 采集（管电压 = 80 kV，管电流 = 500 μA，等向分辨率 = 48.9 μm，持续时间 = 10 分钟）。
5. 执行静态 PET 采集（下部/上部歧视性级别 = 350/650 keV;正时窗口 = 3.438 ns;持续时间 = 15 分钟）。

4. 替代成像策略

1. 为了对后腿的MDA-MB-231细胞进行早期评估， 为生物发光（即表达荧光素、MDA-MB-231-LUC 13）或荧光成像（即表达绿色或荧光蛋白的细胞，MDA-MB-231-GFP/RFP ^13） 接种 ^{1.5 x 10 5} 标记细胞/200μL。使用临床前光学成像系统检测肿瘤细胞接种后体内MDA-MB-231细胞 ^14。
2. 静脉注射微泡后，使用专用扫描仪进行实验超声，得出与MRI 7相媲美的血管化形态 ^{和功能参数} 。

5. 核磁共振成像分析

1. 使用 DICOM 查看器 ¹⁵ 与 DCE ^{插件 16，} 并加载 DCE 序列在 4D 模式下，单击顶部 菜单中的" 导入"按钮，选择包含步骤 2.4 中的 MR 图像的 DICOM 文件夹，然后单击顶部 菜单中的"4D 查看器"。
2. 在右后腿的近端三轴骨髓中放置一个圆形的二维感兴趣区域（ROI），目标尺寸为1.5 mm ^2， 最好使用由8个图像组成的序列中的图像编号4或5，因为这些中心图像提供更稳定的结果。
3. 从顶部菜单启动 DCE 插件， 在"绘图 类型"字段中 选择"相对 增强"，并在相应的字段中键入这些数字，从时间点 1 到 5 定义基线范围。将分析导出为具有相应按钮的 .txt 文件，然后选择"DCEraw.txt"作为文件名。
4. 打开RStudio ^17， 通过选择"打开 文件"， 通过[ 文件 ]菜单加载提供的DCE-Script.R文件。通过从菜单中选择" 代码 "，然后" 运行区域 "，然后从" 全部运行"来 运行整个脚本。将输出复制到提供的模板文件名为"图像功能.xlsx"（ 图 2）。
5. 在 DICOM 查看器中，将第二个 ROI 放在动物的后肌内，并重复步骤 5.2–5.4 以获得肌肉 DCE 测量以用于规范化目的。在电子表格"成像功能.xlsx"中，各自的骨骼测量会自动除以相应的肌肉测量，以便进行规范化。
6. 对所有动物重复步骤 5.1~5.5 并完成电子表格。

6. PET/CT 分析

1. 打开PET/CT分析软件，通过单击"文件"导入步骤3中 获取的数据 ，然后是" 手动导入 "。标记 ct. img. hd 和 pet. img. hdr 文件。单击" 打开 "并选择" 全部导入 "。
2. 通过选择"常规分析" 打开数据集 ，后跟" 确定 "。
3. 选择 "ROI 量化 "，后跟" 创建 "，然后选择" 从模板创建 ROI"。 将一个二维 ROI 放在右后腿的近端轴骨髓中，约 4 mm x 6 mm。
4. 选择 "RO（目标1叠加）"， 并在Bq/mL中写下平均值、最小值和最大值。
5. 计算最大标准化吸收值（SUV _最大值 ）：将最大值 （Bq/mL） 除以注入活性，将结果乘以动物的重量（以克为单位）。在电子表格中输入结果（ 图 2）。

7. 确定肿瘤接受率

1. 要诊断右后腿的肿瘤生长，请在第 30 天 PI 上重复 MR 和 PET/CT 成像，如上所述。
   注： 肿瘤将在第30天PI清晰可见，并具有T2w超光病变和MRI的清晰对比度增强，以及PET/CT中明显 _升高的 SUV最大值。根据以前的实验，60%~80%的动物的右后腿会形成转移。
2. 通过添加额外的"Tumor"列来完成电子表格，并输入"1"，每个动物呈现转移，和"0"为每一个没有可见的肿瘤负担的动物（ 图2）。 在"下载"文件夹中将电子表格另存为"图像功能.xlsx"。

8. 功能选择

1. 要确定预测未来肿瘤生长的最相关功能，请将电子表格导入开源数据可视化、机器学习和数据挖掘工具包 ¹⁸ 。
2. 从 "数据"菜单将 " 文件"子 例程绘制到右侧的工作区中，然后双击它。通过单击"文件夹" 图标并选择 文件"图像功能.xlsx"加载电子表格。选择" 导出 "工作表，并将目标属性分配给变量 "Tumor"。 将" 跳过" 函数分配给动物编号（图 3）。
3. 从"数据 " 菜单中绘制" 排名"子例 程到工作区， 并在它们之间 绘制 一条线 ，将"文件"和"排名"子例程连接。
4. 通过双 击其 图标打开"排名"子例程，然后选择" 信息增益" 算法 ¹⁹ 。
5. 从获得的五个参数中，使用前三个进行进一步分析（SUV _最大值 、PE 和 AUC）。
   注意：这些参数反映代谢活动（SUV _最大值 ）和组织血管化（PE和AUC）。

9. ML 分析

1. 打开RStudio 3.4.1 ^17， 然后通过[文件]菜单加载提供的"火车模型.R-Script"。 File
2. 通过键入：安装 .包（c（"caret"，"readxl"，"pROC"，"RcmdrPlugin.EZR"，"ggplot2"） 安装所需的库（这只需要完成一次）
3. 若要加载所需的库并设置"下载"文件夹作为工作目录，请在"TrainModel.R"脚本中选择第 3-5 行。
4. 通过单击菜单中的" 代码 "，然后单击"运行所选 行"来运行所选 代码 。

10. 训练 avNNet ML 算法

1. 要训练 avNNet 算法，请从 TrainModel.R-Script 中选择行 8-39（参见步骤 9.1）。
2. 通过单击菜单中的" 代码 "，然后单击"运行所选 行"来运行所选 代码 。

11. 分析ML算法的结果

1. 要评估诊断准确性的标准参数（灵敏度、特异性、正负预测值和可能性比率），请从 TrainModel.R-Script 中选择第 41~50 行。
2. 通过单击菜单中的" 代码 "，然后单击"运行所选 行"来运行所选 代码 。

12. 将最终模型的接收器操作特性 （ROC） 曲线与组成参数的 ROC 曲线进行比较

1. 要执行 DeLong 的测试以将模型的 ROC 曲线与其组成参数的 ROC 曲线进行比较，请从 TrainModel.R-Script 中选择行 52–62（参见步骤 9.1）。
2. 通过单击菜单中的" 代码 "，然后单击"运行所选 行"来运行所选 代码 。

大鼠从MDA-MB-231乳腺癌细胞的手术和注射中迅速恢复，然后于第10天和30日接受M-和PET/CT成像（ 图1）。 图 2A 中对大鼠右近性头骨进行了具有代表性的DCE分析。通过选择"导出"按钮 并选择 "DCEraw.txt"作为文件名来保存 DCE 原始度量。

动态参数、AUC、PE 和洗涤的后续计算在 RStudio 中用相应的脚本执行。DCE 测量值的输出必须保存为"下载"文件夹中的"DCEraw.txt"，以便脚本可以直接运行，而无需提供其他配置来提供数据表，如图 2B 所示 。这些数据被复制到提供的电子表格（ 图2C）。 同样，肌肉组织的DCE参数被确定并转移到电子表格（图 2D，E）。 E 这些值通过将骨骼测量除以肌肉测量值来规范化;这在电子表格中自动执行。从PET/CT，计算的SUV _最大值 随后被转移到表中（ 图2F）。

在PI第30天，所有动物都进行了评估，以确定它们是否发展成转移，通过将阳性肿瘤负担编码为"1"，将健康动物编码为"0"，在电子表格的最右边列（图 2C）中完成 。

该电子表格被导入到开源数据可视化、机器学习和数据挖掘工具包中，功能排名显示，SUV _max、PE 和 AUC 是预测转移性疾病的三大功能（ 图 3 ）。这些参数反映代谢活动（SUV _最大值 ）和组织血管化（PE和AUC）。

运行 TrainModel.R 脚本会自动导入电子表格并计算 avNNet。确定了最佳超参数组合（ 图4A）， 然后使用最优超参数组合计算最终模型（ 图4B）。 随后，计算了一组标准诊断 参数（图4C）， 并绘制了模型的ROC曲线 （图4D）。

正结果如图 4B + D 所示 。将模型的 ROC 曲线与三个成分（即 AUC、PE 和 SUV _最大值 ）的 ROC 曲线进行比较后发现，该模型的表现明显优于所有三个成分（P = 0.01 表示 AUC，p = 0.003 表示 PE，p = 0.07 表示 SUV _最大值 ）。三个选定参数与 avNNet 的组合更加敏感，从而可以预测宏观疾病，总体精度为 85.7%（95% 置信区间 = 67.3%~96.0%）。这些结果来自对28个样本的分析。通过增加动物的数量，可以进一步缩小置信区间。

负结果可以获得，如此处所述。精度度量对特定类型的机器学习算法和数据预处理步骤高度敏感。神经网络，特别是，往往表现更好，当输入数据正常化。这是通过协议第 10 节中的"BoxCox"功能实现的（在提供的 TrainModel.R-Script 中，第 22 行和第 36 行）。通过将方法更改为"nnet"（提供的 TrainModel.R-Script 中的第 21 行和 35 行），避免规范化并使用其他算法（例如，神经网络不平均），从而在 ROC 曲线下产生 0.594 的面积（ 补充图 1 ）。这样的模型未能显著优于其三个成分（全部为 p > 0.15）。

由于该脚本针对 RStudio 3.4.1 和 caret 包版本 6.0-84 进行了优化，因此使用不同的软件版本可能会产生不同的结果。使用本手稿中使用的软件版本运行提供的脚本将给出类似的结果。但是，如果读者旨在修改脚本、添加其他变量、更改文档文件夹或文件名，或更详细地修改机器学习算法，则需要对代码进行相应的调整。对于这些情况，护理包手册提供了深入的解释 ²⁰ 。

图 1：代表性 MR 和 PET/CT 映像。 MR 和 PET/CT 图像的右后腿动物在研究过程中未发展转移（两个最左边的列，有第 10 天和第 30 天 PI 的图像），以及第 10 天和第 30 天之间出现转移 PI 的动物（最右的两列，标有箭头的转移）。请注意 T2w 图像（上行）中转移的高信号强度、曲线下增加区域（AUC;第二行）所描绘的对比度增强，以及 PET/CT（SUV _最大值 ;第三行）中增加的最大标准化吸收值。请注意，在第 10 天 PI（第 1 和第 3 列）获得的图像与未出现骨转移的动物之间没有明显的差异。这个数字是由埃尔曼等人 ^修改的 。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：评估成像功能并编译为电子表格。 （ A ） 使用DCE插件 ^16， 使用免费软件DICOM查看器 ¹⁵ 分析近体骨髓的动态对比度增强。保存了相应的测量值，并且 （ B ） 在 RStudio 17 中提供了 DCE-Script.R 文件，进一 ^{步进行了分析} 。（ C ） 输出被复制到电子表格中（有关模板的附加材料）。（ D ） 同样，DCE测量对相邻的肌肉组织进行，使用RStudio （ E ） 进行分析 ，然后复制到电子表格中。通过将骨骼测量结果除以肌肉测量结果 （C; 鲑 鱼阴影细胞），数据被规范化。（ F ） PET/CT测量是使用供应商的软件进行的。通过将各自的测量值除以注射活性并将其乘以动物的体重来计算最大标准化摄取值。结果随后被复制到电子表格中。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3：功能排名。 通过"文件"子例程导入电子表格，然后通过"Rank"子例程分析，在开源数据可视化、机器学习和数据挖掘工具包 ¹⁸ 中对采集的成像功能进行排名。 请单击此处查看此图的较大版本。

图4：代表RStudio输出。 机器学习算法是使用 RStudio ^{17 开发的，} 并提供了 TrainModel.R-Script 文件。（ A ） 模型平均神经网络的不同超参数组合之间的网格搜索显示，三个神经元的大小和0.0005的衰减是最佳的。（ B ） 利用这种超参数组合，对全网进行了训练和交叉验证，总体精度达到85.7%。（ C ） 诊断精度的标准参数，包括灵敏度、特异性、正负预测值和可能性比，都是从混淆矩阵中计算出来的。（ D ） 交叉验证模型的具有代表性的 ROC 图揭示了曲线 （AUC） 下 0.917 的面积。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充图1：负结果。 将 ML 算法更改为神经网络而不进行平均和避免输入参数规范化，导致 ROC 曲线下区域从 0.917 （ 图 4D ） 下降到 0.594。 请点击这里下载此文件。

补充图2：替代功能排名。 与图3中描述的标准方法相比， 还 引入了一个随机变量（"随机";以蓝色突出显示），其重要性包含在排名中。这种方法证实了SUV最大值 _、PE和 AUC 变量的应用选择。 请点击这里下载此文件。

ML 算法是强大的工具，用于将多个预测功能集成到组合模型中，并在单独使用时获得超过其单独成分的精度。尽管如此，实际结果取决于几个关键步骤。首先，使用的ML算法是一个关键因素，因为不同的ML算法产生不同的结果。此协议中使用的算法是 avNNet，但其他有前途的算法包括极端梯度提升 ^{21 或} 随机林。RStudio 的 caret 包 ²⁰ 提供了大量不同的算法（目前是 >175），通过简单地更改单行代码（例如，将方法 ="avNNet"到方法="rf"）和将 TunedGrid 设置调整到相应的 ML 算法，建议的协议在从一个算法切换到另一个算法方面非常灵活。有关详细信息，请参阅 caret github 存储库 ²² 。Fernández-Delgado等人发表了关于不同算法及其在不同分类问题方面性能的出色 ^概述 ，可以作为其他实验的起点。

另一个关键因素是选择要包括在 ML 算法中的相关功能。该协议建议使用滤波器方法"信息增益 ^"19， 按降序对可用要素进行排名，并使用最相关的功能来训练avNNet。筛选方法仅基于一般假设，如与变量的相关性来预测，因此研究人员应独立于 ^{使用24、25 的分类器预先 选择特征} 。这些方法在计算时间上特别有效，并且对过度拟合非常可靠。但是，将相关功能与不相关要素分离的截止项由用户定义，使其有点任意。对于建议的协议，使用信息增益最高75%的功能，对应于SUV _最大 、PE和 AUC。但是，可以通过包括一个与目标没有关系的随机变量，计算其信息增益，然后将其与实际特征的信息增益进行比较来系统地加强这种选择（ 补充图 2 ）。这种稍微复杂一点的方法进一步证实了上述三个功能的选择是最相关的。尽管如此，还是存在几种不同的筛选方法，以及其他选择与特定分类器算法有关要素的方法，如特征提取和包装方法。不同的特征选择方法可能会产生不同的结果。

为了确保 ML 算法的通用性，进一步防止过度拟合，建议的协议应用留一出交叉验证 （LOOCV）。但是，最好的方法是从整个数据集中随机删除子集，并将其视为测试集。然后对 ML 算法进行数据剩余（即训练集）的培训，以随后预测测试集的结果。但是，此方法需要足够大的数据集。对于较小的样本量，LOOCV的应用是常见的，因为它提供了模型的真实泛化能力几乎无偏的估计 ²⁶ 。在 LOOCV 中，第一个数据点将从数据集中删除，并且 avNNet 使用保留的数据进行训练。然后，预测并保存以前预扣数据点的结果。此过程将遍起去所有数据点，以便最后使用未用于训练算法的数据预测每个结果。其他验证方法包括 x 倍交叉验证（通常为 10 倍），并且可以通过将代码中各自的 trainControl 参数更改为方法"CV"来轻松应用。

从定量的观点来看，医学图像通常以非常基本的方式进行评估，主要依靠对潜在可疑病变或 ^27、28 区域的大小 ^{和 形状的测量} 。然而，医学数字成像和通信 （DICOM） 标准的优点是，它允许提取许多功能，称为放射学。术语"辐射"最初被定义为大量图像特征 ²⁹ 的高通量提取，但随后被扩展为包括图像转换为更高维数据 ^30。 然而，较高的维数数据主要用于识别相关性，而不是导致 ^30。 该协议中描述的特征介于典型的放射性特征（如大小和形状）和放射学之间，因为它们类似于普遍接受的血管化和代谢活动参数。这提供了一个潜在的因果关系，传播的肿瘤细胞的微入侵。如果用户需要，可以使用不同的软件包 ³¹ 执行辐射功能的提取。

提供的协议不限于有限数量的要素。因此，它可用于大型辐射数据集。然而，随着数据集的增长，上述特征选择问题变得越来越重要。提出的方案也可以转移到不同的研究环境，例如，从肿瘤学，感染，或炎症 ^领域32。