永乐五年(1407年)七月初四,徐皇后去世,年仅四十六岁。《明太宗实录》记载了这样感人的诀别一幕:徐皇后病危之际,朱棣前往探视,徐皇后嘱咐朱棣说:“当今天下虽说太平,不用兵甲,但民生并没有完全恢复,希望圣上多加体恤。”当朱棣问起皇后还有什么要说的时,徐皇后说:“在用人时,要广用贤才,明辨是非邪正,不要因为一个人有小过就弃之不用,也不要因为一个人有小聪明就委以重任,教导子孙以学业为重,对宗室以恩义相待。”并表示自己不能再报答朱棣的恩情,让他不要骄纵她的娘家人。朱棣听着,不禁泣不成声,徐皇后也泪流满面,在弥留之际还不忘劝朱棣以国为重,说自己生死有命,只希望他弃绝私恩、珍重自爱,别为自己过于伤心。
徐皇后临终之际,最大的遗憾是没有机会和朱棣再回一次北京,报赏当年靖难时随她一起守城的将校士民之妻,所以将这件事交代给皇太子朱高炽替她完成。永乐七年朱棣北巡,皇太子在南京监国,在车驾到达北京的第二天除赏赐北京官员军民之外,也对守城妇女给予赏赐,完成了徐皇后的遗愿。徐皇后还告诫皇太子朱高炽要“敬以事上,仁以抚下,肃以正家,恩以睦亲”,要他时刻记在心上。对于皇长孙朱瞻基,徐皇后也有教诲,让他专心致志、勤奋学习,并对朱棣说这个孙儿是远大之器,让他善加看待。徐皇后去世后,朱棣情难自抑,恸哭垂涕,群臣只能对他婉言劝慰。朱棣对群臣说皇后仁爱明察、贤能善良,将皇后比作东汉明德马皇后和唐代长孙皇后那样的贤后,并说皇后虽然身处宫中,但一心爱护百姓。想到皇后音容宛在,他痛惜道:“从此朕在宫中再也听不到皇后的直言了。”