风琴树脂铸造是一种可追溯到17 ^世纪的 技术 ¹ 。现代树脂铸造的第一个例子之一是通过尸检对人体肝脏进行的。肝内胆管填充与明胶混合的造影剂，然后用X射线CT扫描进行成像 ² 。DUCT技术的目的是以3D形式串联可视化，数字化和分析两个管状树脂浇注网络。

DUCT 基于对单系统肝脏树脂铸造的广泛现有知识 ^{3 、 4 、 5 、 6 、 7 、 8} ，并扩展到两个系统的同时进行 3D 可视化和分析 ⁹ 。DUCT通过将两种不同对比度的不透射线树脂混合并将这些树脂注入两种不同的网络（特别是胆总管和门静脉）来将单树脂铸造先进到双树脂铸造。DUCT可以应用于年轻的产后小鼠，其结果最早可在出生后第15天（P15）产生可重复的结果。与基于显微镜的成像技术相比，主要优点是DUCT速度更快，无抗体，并且肝组织自发荧光不会干扰成像。此外，DUCT还提供描述流明状态，内径，网络连接和灌注的定量数据。区分腔内形成细胞的存在及其事实上的成形形成为管子对于分析存在导管细胞但不形成管的器官至关重要，如Alagille综合征 ¹⁰ 中的情况。DUCT的主要缺点是树脂的穿透力有限，树脂是粘稠的，不会进入小口径（<5μm）的管子。DUCT可应用于确定注射入口点后的任何肾小管结构，如动脉和静脉循环系统、气道、肝外胆管或淋巴管。因此，它可以促进其他组织（如肺和胰腺）的整个器官结构分析。

MicroCT分割图像可以使用市售的成像软件（如ImageJ）或定制编写的管道（例如MATLAB）进行处理。可以定性地分析树脂注射的肝脏的网络扩展和连通性，或者定量分析单个系统的体积，长度，分支，曲率，以及两个系统之间的相互作用，例如两个系统之间的距离，或分支点依赖性（系统1是否分支靠近系统2分支？）。包括树脂注射、microCT扫描和CT数据分割在内的DUCT管道，结合对两个管状系统结构机制的详细定量分析，可以为动物模型中的全肝分析提供标准。

本研究中描述的协议获得批准，并遵循斯德哥尔摩动物研究伦理委员会（Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd）的动物福利规则和法规。本研究中使用的动物是混合C3H / N和C57bl6J背景上的野生型或纯合Jag1H268Q突变小鼠。男性和女性都包括在研究中。这些动物在出生后第15天或作为3-8个月的成年人使用。

1. 双树脂注射

1. 制备
   1. 准备树脂溶液。对于双体系树脂注射液，请按照步骤1.1.2-1.1.4中所述准备黄色和绿色树脂。
   2. 每只小鼠准备1 mL等分试样的稀释树脂。
   3. 黄色树脂：用透明稀释剂以3：1的稀释液稀释黄色硅橡胶（高不透射线性），制备注射用黄色树脂。
   4. 绿色树脂：将蓝色硅橡胶（检测不到的不透射线性）与透明稀释剂以1：1稀释混合，制备蓝色树脂。为了生成绿色树脂，将稀释的蓝色树脂与稀释的黄色树脂以1：1的比例混合。彻底涡旋绿色树脂，直到颜色均匀。
      注：蓝色树脂具有非常低的不渗透力，用microCT无法检测到，因此需要用黄色树脂稀释以产生具有不同不透射线性的两种树脂。
      注意：树脂可能含有铬酸铅，这是一种致癌物质。它在火灾中产生有毒气体。小心处理，并将树脂作为危险废物处理。
   5. 按照步骤 1.1.6-1.1.11 中所述，使用管准备两个注射装置（注射装置 #1 和注射装置 #2）。
      注意：对于成年小鼠（>P30（产后第30天）= P30 - 2年），使用注射套件#1（PE10管，外径为0.6mm）进行胆总管注射，使用注射套件#2（PE50管，外径为0.96mm）进行门静脉注射。对于年轻的产后小鼠（高达P30），准备两个#1注射套件，一个用于胆管，一个用于门静脉注射（没有注射组#2，因为门静脉太窄而无法容纳PE50管）。
   6. 要准备注射套件#1，切下30厘米的PE10管，并通过拉动用手拉伸管子的一端，直到它变得尽可能薄（ 图1A ，B ，直径约为0.15毫米，非拉伸PE10管的直径为0.6毫米）。
   7. 对角切割拉伸PE10管的尖端，形成斜尖（ 图1B ）。
   8. 将PE10管的非拉伸端连接到30 G针（ 图1A ，注射套件#1）。
   9. 要准备注射套件#2，切开30厘米的PE50管，并通过拉动用手拉伸管的一端，直到它变得足够薄以适合门静脉（ 图1A ，B ，约0.7毫米，非拉伸PE50管直径为0.96毫米）。
   10. 对角切割拉伸PE50管的尖端，形成斜尖（ 图1B ）。
   11. 将PE50管的非拉伸端连接到23 G针（ 图1A ，注射套件#2）。
       注意：每个注射套件只能用于一次注射，因为树脂会在注射器和管路中硬化。根据小鼠胆总管和门静脉的大小，根据其年龄，基因型和表型调整拉伸和斜尖的大小。当不确定管道的尺寸和配合时，请在切口之后和管道填充树脂之前将管道插入适当的管道或容器中。如果管道太宽而无法放入管道/容器中，请进一步拉伸。
   12. 通过异氟醚吸入麻醉动物（首先在诱导室中4%，使用鼻锥约2%）。
   13. 将鼠标放在解剖垫上的通风长凳上，同时鼠标通过鼻锥呼吸异氟醚。通过研究所/ IRB推荐的方法验证动物是否失去知觉，例如，通过捏住其中一只爪子。
       注意：异氟醚吸入时可能导致嗜睡或头晕，并可能通过长期或反复接触对心血管系统和中枢神经系统造成损害。不要吸入它。在通风的长凳和通风良好的区域处理该物质。
       注意：可以使用另一种麻醉方法，只要它与心脏灌注相容。
   14. 一旦动物失去知觉，用70%乙醇喷洒腹侧，以防止毛皮干扰。
   15. 使用皮肤剪刀，从腹腔中线开始切开皮肤，筋膜和肌肉层，然后切入胸腔以暴露内脏。
   16. 用镊子抓住腩子，抬起胸骨，切开两侧的横膈膜和肋骨笼，露出心脏和肺部。
   17. 用剪刀切开胸腔左侧和右侧的肋骨，取下肋骨笼。格外小心不要损害肝脏，因为这会导致树脂泄漏。
   18. 使用直镊子，将心脏拉向肝脏并切除右心房。
   19. 将连接到蠕动灌注泵的蝴蝶针（23 G）插入左心室。用Hanks平衡盐溶液（HBSS）和肝素（1 U / g小鼠体重）经心电过灌注小鼠。灌注 3 分钟，灌注速率为 5 mL/分钟。
       注意：如果正确灌注小鼠，内脏器官会变得苍白，尤其是肝脏。相反，如果肺部变白，则将针头插入右心室，并应重新定位。灌注后，小鼠被外血化，可以从鼻锥和异氟醚中取出。
   20. 关闭异氟醚泵。
   21. 树脂注射 - 胆道体系树脂浇注
       1. 将鼠标移动到解剖显微镜，腹部向上，尾巴朝向实验者，然后远离实验者。感兴趣的解剖学标志如图 2A所示 。
       2. 通过将肠道移动到一侧来定位下腔静脉（ 图2A ）。使用弹簧剪刀在下腔静脉中做一个小的横向切口，以释放肝血管压力（ 图2Bi ）。
       3. 暴露胆总管和门静脉，如步骤1.2.4-1.2.6中所述。
       4. 使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）润湿的棉签将肠道和胰腺移动到（实验者的）右侧。
       5. 使用PBS润湿的棉签将肝脏的腹侧向心脏翻转，以暴露内脏表面和肺门区域。
       6. 找到从肺门区域穿过胰腺并进入Oddi括约肌处肠道的胆总管（ 图2Bii ，用黄色虚线勾勒的胆总管，黑色箭头指向Oddi的括约肌）。
          注意：通过洒上PBS来确保肝脏在整个过程中是湿润的。
       7. 使用直镊子从胆总管清除周围组织（面积〜5毫米）。将丝线（尺寸4-0，0.17毫米，3-5厘米长）放在胆总管下方（ 图2Bii ），并在胆总管周围打一个松散的手结（ 图2Biii ）。
          注意：选择一个区域作为结，位于肺门区域和Oddi括约肌之间的中间区域，并且距离门静脉有一定距离，以便在胆总管周围收紧缝合线后，它不会干扰门静脉注射。
       8. 将弹簧剪刀平放在胆总管上，在胆总管进入胰腺和肠的地方，在Oddi括约肌旁边的胆总管上做一个斜切口。（ 图2Biv ），黄色虚线勾勒出Oddi区域的括约肌，用黑色箭头强调）。
          注意：这是一个关键步骤。做一个斜切而不是横向切口，并做一个切口;不要切断胆管。切割整个胆管使得管道的插入非常具有挑战性。
       9. 在使用前，将1 mL黄色树脂与50μL固化剂混合（通过填充和清空1mL注射器），并用树脂 - 固化剂混合物填充1mL Luer注射器。
       10. 将填充的注射器与管子（1组）连接。按压柱塞以完全填充管道。确保树脂/固化剂混合从管尖滴落。
           注意：避免并清除注射器和管路中的气泡，以获得最佳效果。
       11. 使用镊子，拉直胆总管切口周围的区域，并将管插入胆总管的开口（ 图2Bv ），斜尖的最长边缘向下朝向胆管的背侧。这种方向确保树脂可以从朝上的管道开口中流出，进入管道（ 图2Bv ）。
       12. 拧紧丝线结，将管子固定在胆总管内（ 图2Bvi ）。
       13. 将树脂注入胆总管。观察胆囊和单个肝叶。
       14. 用PBS润湿的棉签按摩肝脏，以帮助均匀地涂抹树脂。树脂填充的胆管的末端分支（在野生型小鼠中）在肝脏表面隐约可见。
           注意：预计填充肝脏的时间是30-100秒。
       15. 当树脂点出现在肝脏表面（ 图2Ci ，蓝色箭头）或遇到阻力时，停止注射树脂。
           注意：尽可能快地工作，因为树脂在加入树脂固化剂后开始硬化。添加固化剂的工作时间约为15分钟。
       16. 将管子从胆总管中拉出，然后用镊子快速拧紧丝结，以防止树脂泄漏出来。切掉丝线的松散末端，这样它们就不会干扰门静脉注射。
       17. 将含有树脂的管路和剩余的树脂处理成危险废物，将针头扔进尖锐的废物中。
       18. 树脂注射 - 门脉树脂浇注
           1. 使用直镊子从其进入肝脏约2厘米处清除门静脉（面积〜5mm）与周围组织。将丝线（尺寸4-0，0.17毫米，3-5厘米长）放在门静脉的清除区域下（ 图2Ci ），并系上松散的手结（ 图2Cii ）。
           2. 在肝脏和结的门静脉远端做一个纵向切口（ 图2Ciii ）。
           3. 将1 mL绿色树脂与50μL固化剂混合（通过填充并排空1mL注射器），并用树脂固化剂混合物填充1mL鲁尔注射器。
           4. 将填充的注射器与管子连接（>P30小鼠的设置#2， 注意：避免并清除注射器和管路中的气泡，以获得最佳效果。
           5. 使用镊子，通过将周围组织拉向实验者来拉直门静脉，并将斜尖最长边缘的管子插入血管的背侧（ 图2Ciii ）。
           6. 拧紧丝线，将管子固定在门静脉中。
           7. 将树脂注入门静脉。观察血管充满树脂。用PBS润湿的棉签按摩肝脏，以帮助均匀地涂抹树脂（ 图2Civ ）。
           8. 当所有血管都充满（门静脉的末端在肝边缘可见）或遇到阻力时，停止注射树脂。
              注意：由于树脂在添加固化剂后开始硬化，因此快速工作。添加固化剂的工作时间对于注射剂#1约为15分钟，对于注射剂组#2约为25分钟。
           9. 从门静脉中拉出管子，取出管子，然后用镊子快速拧紧丝结，以防止树脂泄漏出来。
           10. 将含有树脂的管路和剩余的树脂处理成危险废物，将针头扔进尖锐的废物中。
           11. 肝脏解剖和固定
               1. 通过将整个肝脏从周围组织和隔膜上切开来解剖。
               2. 轻轻地将整个肝脏置于空的50 mL锥形管中，腹侧朝上，背侧放在锥形管壁上，以防止肝脏变形。将锥形管水平存放在4°C下过夜，以使树脂完全硬化。
                  注意：任何足够大以适合肝脏的容器都可以代替50 mL锥形管。使用平底容器会增加肝脏不变形的可能性。
               3. 将肝脏分成单独的叶。选择将用于microCT分析（1.4.4-1.4.5）或质量控制（1.4.6-1.4.8）的波瓣。可选择使用整个肝脏进行光学清除和microCT，而不将其分成单独的肺叶。
                  注意：每个叶的胆道和血管系统的肝脏结构不同，因此需要匹配的叶分析。光学清除不会干扰microCT扫描，并且用于质量控制的凸轮随后可以使用microCT进行扫描。相反，用microCT扫描的样品随后可以光学清除进行比较。因此，全肝分析是可能的。在野生型小鼠（C3H / C57bl6遗传背景）中，首先通过树脂注射填充正确的内侧叶，使其成为适合microCT分析的叶，具有最高的可重复性。左侧叶是最大的叶，因此可以直接预先筛选注射质量。用于质量控制和microCT扫描的叶（或整个肝脏）的选择取决于动物模型和研究问题。
               4. 在通风罩中，准备4%甲醛溶液（每管10-20毫升）。用4%甲醛在4°C下固定用于microCT的叶片过夜，然后用PBS洗涤一次（每管10-20mL）。
               5. 将甲醛废物收集在单独的容器中。将肝叶保持在PBS中，在4°C下进行短期储存，或将70%乙醇长期储存。继续执行第2节：微型计算机断层扫描。
                  注意：甲醛如果吞咽、吸入或与皮肤接触，会引起急性毒性。甲醛是一种易燃液体和蒸气。它会导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。可能引起皮肤过敏反应。吸入（浓缩或粉末）致命。可能引起呼吸道刺激。怀疑引起遗传缺陷。可能导致癌症。对器官（眼睛，中枢神经系统）造成损害。预防措施 - 远离热源、热表面、火花、明火和其他点火源。禁止吸烟。戴上防护手套和防护服。如果发生溢出，请立即脱下所有被污染的衣服。如果与皮肤接触：用水冲洗污染区域。如果吸入：将人转移到新鲜空气中，并在呼吸舒适时监测呼吸。立即致电中毒中心/医生。如果进入眼睛：用水冲洗眼睛几分钟。如果存在且可能，请取下隐形眼镜。
               6. 为了进行质量控制，用50%甲醇（与去离子水混合）固定剩余的裂片（至少一个）至少4小时，在室温下摇摆，然后在室温下100%甲醇摇动过夜。将甲醇废物收集在单独的容器中。
                  注意：甲醇如果吞咽、吸入或与皮肤接触，会引起急性毒性。甲醇是一种易燃液体和蒸气。戴上防护手套和衣服。处理时避免呼吸，远离火源和热源。使用后彻底清洗皮肤。如果发生溢出，请立即脱下所有受污染的衣服。用水冲洗皮肤。吸入时：将人转移到新鲜空气中，保持呼吸舒适。如果吸入、吞咽或暴露，请致电中毒中心/医生。
               7. 在通风罩中，制备苯甲醇和苯甲酸苄酯（BA：BB，1：2）（每叶5-10mL）溶液。
               8. 将肝叶置于含有BABB溶液的15或50mL聚丙烯管（取决于叶的大小）中。让它在室温下摇摆，直到透明。该步骤可能需要2-16小时，具体取决于波瓣的大小。
                  注意：BABB溶液可溶解某些类型的塑料。将样品储存在聚丙烯管或玻璃容器中是安全的。
                  注意：苯甲酸苄酯吞咽时会引起急性毒性。它对水生生物有毒，具有长期影响。注意事项：处理后彻底清洗皮肤。吞咽、接触皮肤或吸入时有害。避免吸入烟雾/蒸气。处理后彻底洗手。使用本产品时，请勿进食、饮水或吸烟。如果吞咽 - 如果身体不适，请呼叫中毒中心/医生 在通风处使用。收集溢出物。将内容物/容器处置到经批准的废物处理厂。
               9. 检查注射的质量。只有注射良好的肝脏才应使用microCT进行扫描。

               2. 微型计算机断层扫描

           12. 通过混合100mL蒸馏水和1g琼脂糖粉来制备1%琼脂糖凝胶。将混合物置于微波炉中，煮沸溶液，直到琼脂糖粉末溶解。
           13. 将1%琼脂糖凝胶回火至~40°C，以避免对肝脏样品的热损伤。
           14. 将感兴趣的叶置于15 mL锥形管中，并用1%琼脂糖凝胶填充至管总体积的约2/3。此步骤可最大限度地减少 CT 测量过程中不需要的样品运动。
           15. 断续器测量
               注意：以下步骤取决于 CT 设备，并且针对不同的 CT 设备和制造商，特定设置和操作可能有所不同。在该协议中，使用的微型计算机断层扫描器配备了纳米焦点X射线管（180 kV / 15 W）和平板动态41|100（4048 px x 4048 px，像素尺寸为100 mm，合并2）用于CT测量。
               1. 将15 mL锥形管与样品一起安装在CT设备的旋转台上，并使其热适应测量室至少1小时。
               2. 当样品经过热适应时，将其置于视场（FOV）的中心。
               3. 优化源样本和样本检测器距离（SSD、SDD）以达到足够的体素分辨率，例如，成人鼠肝样本为12 μm，
               4. 按照 CT 设备制造商的建议设置采集参数（即，加速电压和电流、曝光、分档、平均），以达到足够的检测到信号水平。这些参数不仅与CT设备相关，而且与样品相关，应针对每个样品进行优化。在Hankeova等人 ⁹ 中，设置为：80 kV加速电压，160μA加速电流，400 ms曝光时间和2000张图像。
               5. 开始 CT 测量。使用专用的断层扫描重建软件重建CT数据。

               3. 分析和数据分割

               注：以下步骤取决于图像处理软件。具体设置和操作可能因所使用的软件而异。

               1. 加载 CT 数据：选择" 文件">"导入>命令" 。进一步的选择取决于要处理的CT数据的特定格式。
               2. 使用顶部面板上的 "表面测定" 功能，使用全局阈值对数据中的树脂进行分段。在对话框窗口中，通过将红色"等值"线的位置设置为仅分割树脂填充的容器（即，由显示的"预览面板"中的黄线包含）来确定具有直方图评估的阈值（ 图3A ）。
               3. 在左侧面板上，选择模块 "从体积/CAD/网格创建 ROI" ，以创建树脂填充容器的感兴趣区域 （ROI）。在对话框窗口中，使用选项 "从实体创建 ROI" ，选择已处理卷的名称并确认。
               4. 消除此 ROI 背景区域中噪声簇的错误分段。在右侧面板上标记此 ROI，右键单击它并选择模块 "拆分 ROI" 。
               5. 在对话窗口中，设置 最小体积[体素] 参数以排除所有噪声颗粒 - 该值取决于实验和数据，必须针对要分析的每个样品进行优化（ 图3B ）。
               6. 创建平滑、连续和坚固的运河掩模，树脂铸造 ROI 中不会出现伪影 - 例如，存在气泡或树脂泄漏。
               7. 在左侧面板上，使用模块 平滑 ，将 平滑强度 参数设置为 1 或 2（取决于单个数据，当较高的值可能导致模型变形时，尤其是在处理精细结构时）。如果需要，请运行此过程两次（ 图3C ）。
               8. 识别并分离分段树脂掩模中的各个管状系统。
                  1. 为填充吸收性更强的树脂（用于胆总管注射的黄色树脂）的系统创建单独的ROI，CT数据中的强度值更高。按照步骤 3.2 中描述的过程进行操作。（ 图3Di ）。
                  2. 标记新的 ROI 和树脂掩模 ROI，右键单击并选择减 去 ROI（S） 并从树脂掩模 ROI 中减去新的 ROI，为剩余的管状系统创建新的 ROI（ 图 3Dii ， iii ）。
                  3. 根据操作员的偏好，以各种格式导出两个管状系统的收益，以便在不同的软件中进行后续处理。此外，在体积图形软件中处理由此产生的ROI，以图像或视频的形式导出最终的可视化。

                  Representative Results

                  该怎么办
                  当肝内胆管和门静脉脉管系统都充满良好时，可以成功进行双树脂注射。作为质量控制步骤，清除一个叶（例如，左侧叶）可以验证注射是否成功，然后对感兴趣的叶进行成像。光学清除的波瓣可以在以后使用microCT扫描;因此，可以通过光学清除整个肝脏。在注射良好的小鼠肝脏中，门静脉脉管系统应充满树脂，直到肝脏外围和树脂在侧枝中可见（ 图4 ），并且这种结构在microCT扫描和分割数据中得到了忠实的概括。此外，在几乎延伸到外围的主门静脉分支旁边应可见注射良好的肝内胆管，并且在主要侧支应可见树脂。如果对照波瓣通过质量控制步骤，则可以使用microCT扫描感兴趣的波瓣（包括光学清除的波瓣）。显示了P15小鼠（ 图4A ，B ）和成年小鼠（ 图4C ，D ）来自注射良好的肝脏的分割数据的结果。

                  不该做什么
                  完整的肝脏组织是成功注射的先决条件。切开腹腔和横膈膜时要格外小心，不要意外划伤肝脏组织。如果在此过程中肝脏有物理损伤，树脂很可能在门静脉注射期间泄漏出来（ 图5A ）。如果肝脏受到物理损伤，则不可能实现血管系统的良好注射。

                  一个常见的错误是用树脂填充肝脏，这可能导致可视化或分析的挑战。系统填充不足的原因之一是在注射完成之前针或管尖中的树脂过早硬化（ 图5B ，蓝色箭头，支架描绘了大气泡）。一个好的做法是每只动物使用一套注射剂，并在将固化剂添加到树脂中后快速工作。如果树脂在注射过程中变硬（可以通过半填充系统观察到，这里以半填充的门静脉脉管系统为例），请取出管子，切割管子的尖端（始终对角线以形成斜角尖端），然后推动柱塞。如果树脂再次开始滴落，请小心地重新插入管道并用缝合线固定。如果树脂在针中硬化，请完全更换管子，用树脂填充（避免气泡），小心地重新插入管子，并用缝合线固定它。更换导管可能具有挑战性，特别是在年轻的产后小鼠 图5C，蓝色箭头表示在末端分支中可见的血液）。当血管的尖端充满血液而不是树脂时，可以观察到这一点。为避免这种情况，请确保门静脉（肝外）在注射前不含任何血液。肝脏填充不足的第三个原因是当管子插入肝脏太深并进入分支朝其中一个叶时。为了防止这种情况，将管子插入距离入口至少0.5厘米到肝脏的位置。

                  相反，其中一个或两个系统被树脂填充过多（ 图5D ）。有必要在整个注射过程中目视监测肝脏。使用树脂进行胆道系统浇注比门静脉树脂浇注更具挑战性，因为树脂填充的导管仅在肝脏表面上隐约可见，并且很难评估系统何时接近满以及何时停止。当肝脏表面出现黄色小点（ 图2Ci ，蓝色箭头）时，这表明胆道系统完全填充，树脂开始从导管中泄漏出来。在microCT数据分割过程中，可以手动纠正轻微的树脂泄漏（ 图5D ，右面板）。

                  如果注射压力过高，这可能导致血管或管道破裂（ 图5E ），不可逆地损坏容器或管道结构。肝脏不适合进行microCT扫描或分析。为避免树脂过量填充，请优化每个小鼠模型中用于注射的正确体积和压力。当与受到毒性饮食，遗传修饰或影响胆道或静脉系统或肝僵硬度的肝损伤挑战的小鼠一起工作时，可能需要调整注射压力和体积，因为体积和耐受的压力可能与野生型小鼠不同。该协议描述了两个系统的手动注射，但可以将注射器连接到泵以标准化注射压力。气泡是另一种非常常见的注射伪影，导致管状网络的稀疏填充（ 图5F-H ，蓝色箭头）。为避免气泡形成，请确保注射器和管子不含任何气泡，完全充满树脂，并且在注射前树脂从管子的尖端滴落。在microCT数据上显示为负区域的小气泡可以在后处理步骤中手动校正，尽管这很费力。

                  新鲜是最好的
                  使用鲜黄色树脂是一个关键因素，显著影响两种树脂的对比度和microCT数据的分割。当使用新打开的树脂时（ 图6A ），黄色树脂注入的胆管（亮白色）和绿色树脂注入的门静脉（亮灰色）之间的对比度明显不同。注射新鲜树脂的肝脏很容易使用自动全局阈值进行处理。随着储存时间的延长，树脂会沉淀，对比度会降低。经过3个月的储存，对比度仍然足以区分门静脉和胆管（ 图6B ），但沉淀会影响两种树脂的混合，这可见为填充门静脉中的异质不透明度（图6B，蓝色箭头）。异构对比度会对自动阈值产生负面影响，并需要手动校正，从而增加处理时间。如果树脂的年龄超过六个月，则造影剂已经退化到无法仅根据其对比度将黄色注射的胆管与绿色注射的门静脉区分开来（ 图6C ）。在这种情况下，胆管和门静脉必须根据其直径和在肺门区域中的位置手动分段，并在整个microCT数据中手动跟踪。此过程非常耗时，最好避免。

                  
                  图 1 ：树脂浇注的注射套件。 （ A ）注射套件#1包括一个30克的针头和长约30厘米的PE10管。注射套件#2由23 G针和PE50管约30厘米长组成。（ B ）将管子的尖端拉伸并以一定角度切割，以形成斜角尖端。A 和 B 中的标尺是一个厘米标尺，主要增量为 1 厘米，中间增量为 5 毫米，次要增量为 1 毫米 。请单击此处查看此图的放大版本。

                  
                  图2 ：双树脂浇注流程图。 （ A ）示意图显示小鼠静脉循环系统和心脏具有突出的右心房，应在灌注前切除，以及应插入针头进行灌注以洗去血液的左心室。下腔静脉应在肾脏下方切断，以缓解血管压力。（ 二 ）胆管树脂注射流程图。（i） 缩放图像 （ A ） 描述切断 IVC 的位置。（ii）描绘从肝门区域到Oddi括约肌（黑色箭头）的胆总管（黄色虚线）的图像，在清除的胆总管下有缝合线。（iii） 适合胆总管周围松散的过手结的位置。（四） 黄色虚线和黑色箭头标记奥迪括约肌，显示切口的倾斜角度以及斜角切口后开口应如何出现。（v） 示意图，示意图显示插入时PE10管斜面开口（向上）的方向。（六） 注射的黄色树脂的外观;树脂应容易通过松散打结。IVC，下腔静脉;CBD，胆总管。（ 三 ）门脉树脂注射流程图。（i） 绿色虚线标记来自肺门区域的门静脉。蓝色箭头标记过度填充的胆道系统。（ii） 适合在门静脉周围松散的过手结。（iii） 示意图，示意图显示插入时斜面开口（向上）。（iv） 注射绿色树脂和黄色树脂时出现肝脏;注意肝脏外围树脂填充的血管。PV，门静脉。 图 2A 是使用 Biorender.com 创建的。 请点击此处查看此图的放大版本。

                  
                  图3 ：体积图形软件中的微CT数据处理， （ A ）表面测定，（i）高估等值（当前选择预览以黄色显示），（ii）低估等值，（iii）最佳选择等值，以正确测定门静脉和胆管的表面。（ B ）通过表面测定创建的分割感兴趣区域（ROI），（i）将对话窗口中的值设置得足够高，以便只留下一个段（最大的一个），（ii）在黄色框中显示较小的（排除的）颗粒。（ C ） 数据的表面平滑，（i） 平滑功能位于左侧面板，（ii） 将平滑强度设置为 1（最大 2）并创建新的平滑 ROI，（iii） 平滑数据。（ D ）分离单个管状系统，（i）在表面测定函数中设置等值，以便仅将胆道系统包括在选择中（当前选择的预览以黄色显示），（ii）标记两个系统的ROI和仅胆道系统的ROI，并从两个系统的ROI中减去胆道系统ROI， （iii）门静脉显示为灰色，胆道系统显示为绿色。 请点击此处查看此图的放大版本。

                  
                  图4 ：注射良好的胆管（BD）和门静脉（PV）系统。 （ A ）出生后第15天（P15）肝脏的光学清除右内侧叶（RML）注入两种树脂到两个系统中。比例尺 1 mm. （ B ） P15 RML 的 3D 渲染如图 （ A ） 所示，描绘了白色的门静脉脉管系统和绿色的胆道系统。比例尺1毫米（ C ）将成人肝脏的光学清除RML注射到两个系统中。比例尺 1 mm. （ D ） 成人 RML 的 3D 渲染如图 （ C ） 所示，描绘了白色的门静脉脉管系统和绿色的胆道系统。H = 肺气孔，P = 外围设备。面板 A、B、D 经 Hankeova 等人许可 ^改编。 请点击此处查看此图的放大版本。

                  
                  图5 ：双树脂肝脏注射的常见挑战。 （ A ）该图像描绘了在腹腔初始打开期间意外划伤的肝脏，并且树脂通过切口泄漏（蓝色箭头）。（ B ）由于树脂硬化导致门静脉系统注射不良。蓝色箭头标记空的终端分支，红色括号标记大气泡。比例尺 1 mm. （ C ） 由于心腔灌注不良，门静脉系统注射不良。蓝色箭头标记在末端分支中可见的血液。比例尺1毫米（ D ）过度填充的胆道系统表现为孤立的树脂球。左侧面板显示光学清除的肝脏，右侧面板显示3D microCT渲染图像。蓝色虚线轮廓描绘了放大区域。黑色箭头标记了在microCT扫描后的光学清除过程中受损的肝脏部分。比例尺1毫米（ E ）树脂注射期间的高压可导致门静脉破裂（本图中的动物携带Jag1H268Q突变），以蓝色箭头标记。比例尺 1 mm.（ F ） 门静脉注射期间树脂中的气泡（蓝色箭头）和 （ G ） 胆道系统注射（蓝色箭头），比例尺 1 mm。 （ H ） MicroCT 扫描气泡（蓝色箭头）、末端分支填充不良（红色支架）和树脂泄漏（黄色箭头），比例尺 1 mm。 请单击此处查看此图的放大版本。

                  
                  图 6 ：差异树脂对比度。 （ A ） 刚打开的黄色树脂产生足够的对比度，以区分树脂注入的门静脉（灰色）和胆管（白色）。（ B ）黄色树脂储存三个月导致树脂沉淀，导致异质性不透明（灰白色门脉，蓝色箭头）。（ C ）长期储存（>6个月）黄色树脂会降低门静脉（灰色）和胆管（灰色）之间的对比度。比例尺 100 μm .请点击此处查看此图的放大版本。

                  Discussion

                  几个关键步骤决定了PUCT的成功，从样品制备到CT设备的参数。为了获得最佳效果，应使用对比度好、注射良好且无气泡的树脂，以便通过自动阈值进行简单的数字处理，从而获得 3D 数据、图像和短片。通过训练并遵循该协议，90%的注射是成功的，并产生可重复的数据。重要的是使用新鲜的黄色树脂来实现两种注射系统之间的最佳对比度。黄色树脂具有很强的不渗透力，而蓝色树脂具有检测不到的不透明度。在打开新的黄色树脂瓶后的前三个月内取得了最佳效果。随着时间的推移，树脂沉淀，经过更长时间的储存（>6个月），黄色和绿色树脂在CT扫描中将不再可区分。对比度较差的图像需要对两个系统进行广泛且耗时的手动跟踪和分割。接下来，拉伸良好的导管对于适应成年小鼠的胆总管和产后小鼠的胆总管和门静脉是必不可少的。注射的入口点必须小心创建。如果胆总管经横向切开，则可能会从周围组织脱落，从而阻止管子成功进入。这一步对于产后小鼠尤其微妙，其中胆总管缩回并"卷曲"，如果它已经脱离其周围组织，使得导管的插入极具挑战性。胆总管进入和注射可能需要一些练习。在用树脂和整个注射过程中制备管道时，请避免气泡形成，因为气泡会在CT图像中产生负空间，并且需要耗时的手动校正。重要的是，在注射过程中和之后，用润湿的棉签在肝脏表面滚动，轻轻按摩肝脏，因为这有利于均匀的树脂扩散。注射完成后，去除管子，必须快速小心地拧紧丝缝结，这样树脂在完全聚合之前不会流出肝脏。为了成功进行microCT成像，必须用琼脂糖将样品正确固定到位，并进行热适应，以消除CT数据中的运动伪影。采集设置也至关重要，应对其进行优化，以达到足够的空间分辨率，从而解析精细结构。

                  可以对注射程序进行技术修改，以实现年轻小鼠的注射。目前，年轻小鼠肝脏的树脂浇注受到足够薄的管的可用性的限制，PE10是最小的市售管材。Tanimizu等人使用玻璃毛细管成功地将碳墨水注入胚胎第17天（E17）胆总管 ¹¹ 。因此，未来对树脂是否可以通过玻璃毛细管输送的测试将是一个值得关注的问题。DUCT进一步适应注射其他管状系统，如肺的气道和肺动脉脉管系统 ⁹ 。双树脂注射剂也可以改性以与其他市售树脂一起使用，或者该协议可用于碳油墨注射剂。

                  DUCT管道的主要限制因素之一是树脂粘度。DUCT 只能用于直径大于 5 μm 的管状结构的树脂浇注。在该数据集中，树脂可以穿透最小直径为 ^5μm9 的管子。这种尺寸限制排除了细小导管和小毛细血管的分析。为了进一步将DUCT管道推进到较小口径的容器，应测试其他市售树脂，或者开发新的低粘度不透射线剂可以提高腔渗透率。

                  在Hankeova等人 ⁹ 中，将DUCT与其他两种常用技术进行比较，双碳墨水注射，然后进行组织清除和标准摄影，以及iDISCO +用α-平滑肌细胞肌动蛋白染色血管和胆管用细胞角蛋白7染色，然后进行3D成像 ⁹ 。DUCT在双重分析（由于肝脏自发荧光高），3D成像和定量（碳墨水注射无法实现）和流明（DUCT为内部腔结构和系统灌注提供数据）方面优于其他两种方法。如上所述，DUCT的主要限制是可以注入和分析的最小流明尺寸（5μm限制），其中碳墨水注入和iDISCO +都表现更好的参数。DUCT 优于单系统树脂铸造 ^{3 ， 5 ， 6} ，因为它允许单独分析每个注入系统，并且还有助于双 3D 研究以研究两个系统之间的架构关系。

                  DUCT可以应用于3D中研究任何两个管状网络。作为原理证明，DUCT用于可视化肺的肝胆和门静脉系统以及肺动脉脉管系统和气道 ⁹ 。肝内胆管在门静脉附近发育，门静脉提供结构模板和信号中心，调节胆道树的生长和分化 ¹² 。在Hankeova等人 ⁹ 中，DUCT在人类儿科疾病Alagille综合征的小鼠模型中探索了胆道再生。DUCT揭示了以前未报道的胆道系统用于实现野生型体积的架构机制 ⁹ 。Alagille综合征小鼠使用两种不同的策略：（1）在肝脏的肺门和中央区域，胆道系统增加了其分支，（2）在肝脏外围，从头产生的胆管高度曲折。这两个因素结合在一起，产生了接近正常的胆道系统体积，尽管结构异常。此外，DUCT检测到异常的胆管分支，该分支与门静脉分支和胆管在两个门静脉之间形成连接桥无关 ⁹ 。这些表型在单个树脂铸件中是不可能检测到的，并且在2D组织学切片中可能会被误解为胆管增殖。因此，DUCT提供了描述整个器官或肺叶水平上两个管状网络的3D结构的数据，并具有定性和深入定量分析的可能性。DUCT可以成为不同动物模型中产后肝脏发育和肝脏再生分析的新标准。

                  Disclosures

                  ERA实验室的一个单独项目由ModeRNA资助。ModeRNA在这里描述的项目/方案中没有作用。

                  Acknowledgments

                  我们感谢Kari Huppert和Stacey Huppert在胆管插管和实验室接待方面的专业知识和帮助。我们还感谢Nadja Schultz和Charlotte L. Mattsson对胆总管插管的帮助。

                  我们感谢以下资助机构的支持：

                  在ERA实验室的工作：Karolinska Institutet（2-560/ 2015-280），Stockholms Läns Landsting（CIMED（2-538/ 2014-29）），Ragnar Söderbergs stiftelse（瑞典基金会的起始补助金），欧洲肝脏研究协会（Daniel Alagille奖），瑞典心肺基金会（20170723）和Vetenskapsrådet（2019-01350）。

                  对于JK实验室的工作：我们感谢MEYS CR（LM2018110）支持的捷克NanoLab研究基础设施。J.K.感谢FSI-S-20-6353的支持。

                  Materials

                  Company Catalog Number Comments 1.5 mL SafeSeal micro tubes Sarstedt 72.706 23 G butterfly needle with tubing BD bioscience 367283 23 G needle BD bioscience 305892 30 G needle BD bioscience 305106 Agarose Top-Bio Benzyl alcohol Sigma Aldrich 108006 Benzyl benzoate Sigma Aldrich B6630 Corning 50 mL tubes Sigma Aldrich CLS430829-500EA polypropylene Cotton swabs Medicarier 60406 Dissection Microscope Leica Camera AG Leica M60 Dulbecco's phosphate-buffered saline ThermoFisher Scientific 14190144 Ethanol 70% 83801.41 Falcon tube 15 mL Verkon 331.850.084.006 Forceps curved Fine Science Tools 11051-10 Fine Graefe 10 cm curved Forceps straight Fine Science Tools 11050-10 Fine Graefe 10 cm straight Formaldehyde solution Sigma Aldrich F8775 GE Phoenix v|tome|x L 240 Waygate Technologoies micro computed tomography scanner Hanks' Balanced Salt Solution ThermoFisher Scientific 14025092 Heparin Leo Pharma B01AB01 5000 IE/mL Isolfurane Baxter FDG9623 Methanol ThermoFisher Scientific 11413413 MICROFIL Flowtech MV-122 synthetic resin yellow MICROFIL Flowtech MV-120 synthetic resin blue MICROFIL Flowtech MV-diluent clear resin diluent Pasteur pipette Verkon 130.690.424.503 Peristaltic pump AgnThos 010.6131.M20 phoenix datos|x 2.0 software Baker Hughes CT data reconstruction software Rocker 444-0142 Silk suture AgnThos 14757 Black silk, 4-0, sterile, 100 m Skin scissor Fine Science Tools 14058-09 Iris straight tip 9 cm Spring scissor Fine Science Tools 15000-03 Vannas micro, straight tip 2 mm Syringe 1 mL Luer BD bioscience 303172 Tubing PE10 BD bioscience 427401 Tubing PE50 BD bioscience 427411 VG Studio MAX 3.3 software Volume Graphics GmbH CT data processing and analysis software

                  DOWNLOAD MATERIALS LIST

                  References

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                  医学，第175期，

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                  Hankeova, S., Salplachta, J., Van Hul, N., Kavkova, M., Iqbal, A., Zikmund, T., Kaiser, J., Andersson, E. R. DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis. J. Vis. Exp. (175), e62941, doi:10.3791/62941 (2021). … More

                  Hankeova, S., Salplachta, J., Van Hul, N., Kavkova, M., Iqbal, A., Zikmund, T., Kaiser, J., Andersson, E. R. DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis. J. Vis. Exp. (175), e62941, doi:10.3791/62941 (2021).

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                  Copy Citation Hankeova, S., Salplachta, J., Van Hul, N., Kavkova, M., Iqbal, A., Zikmund, T., Kaiser, J., Andersson, E. R. DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis. <em>J. Vis. Exp.</em> (175), e62941, doi:10.3791/62941 (2021). Download Citation Reprints and Permissions