条件性敲除小鼠

定义：

条件性基因敲除小鼠（也叫 Flox 小鼠）是指在目的基因中含有成对的 loxp 位点的小鼠，与 Cre 工具小鼠交配

后可在 特定的组织或细胞中敲除目的基因。

l CKO 如何实现？

重组酶系统（如： Cre-loxP ）介导的位点特异性重组技术。

Cre 是重组酶（ 38kDa ），可识别 34bp 长的 DNA 序列 loxP 。 loxP 两侧各 13bp 构成回文结构，中间 8bp

为非回文结构，因此 loxp 具有方向性。

（当 DNA 分子上存在两个同向 loxP 序列时， Cre 可将两个 loxP 序列之间的 DNA 片段切出并环化，同时

将 loxP 两侧的序列进行连接 ；当 DNA 分子上存在两个方向相反的 loxP 序列时， Cre 可导致 loxP 之间

的序列发生反转。）

l CKO 敲除的是什么？

条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被 Cre 重组酶识别的 loxP 序列，这种基因称为 floxed gene 。

带有 floxed 靶基因的小鼠称为 flox 小鼠。在这种小鼠中，通常采用 DNA 同源重组方法，在拟敲除基

因片段的两侧分别放置一个 同向的 loxP 位点 。

loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为 flox/flox 小鼠

l CKO 敲除何时何地发生？

除了 flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与 ——Cre

工具鼠。

Cre 工具鼠中，将 Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下， Cre 的表达特性决定了靶基因何时何

地发生敲除。

Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞； Cre 的表达水平将影响靶基因在此

种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型 Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或

疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。

（范衡宇老师课件）

实验时，将 flox 小鼠和 Cre 工具鼠进行交配，最后获得 flox 纯合且 Cre 杂合的小鼠。在这类小鼠中，

凡是表达 Cre 的细胞，两个 loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。

（参考资料：南方模式生物官网）

l 交配策略

Ø 将获得的 flox 杂合子小鼠（ geneflox/+ ）分成两部分：

1. flox /+ 小鼠与 Cre 小鼠交配，同时获得 flox 阳性且 Cre 阳性小鼠（该小鼠简写为： geneflox/+ ； Cre+ ） ，

flox 阳性且 Cre 阴性小鼠（ geneflox/+ ）；

2. flox 小鼠自交，获得 flox 纯合（该小鼠简写为： geneflox/flox ）和 flox 杂合小鼠（ geneflox/+ ）。

Ø 为获得 flox 纯合且 Cre 阳性的小鼠，可有两种繁育方法选择：

1. 将获得的 flox 和 Cre 双阳性杂合子小鼠（ geneflox/+ ： Cre+ ）与 flox 杂合子小鼠（ geneflox/+ ）交配，

最终获得 flox 纯合且 Cre 阳性的实验组小鼠（该小鼠简写为： geneflox/flox ； Cre+ ，该小鼠所占后代

比例为： 1/8 ）和 flox 纯合且 Cre 阴性的对照组小鼠（ geneflox/flox ，该小鼠所占后代比例为： 1/8 ）；

2. 将获得的 flox 和 Cre 双阳性杂合子小鼠（ geneflox/+ ： Cre+ ）与 flox 纯合子小鼠（ geneflox/flox ）交配，

最终获得 flox 纯合且 Cre 阳性的实验组小鼠（ geneflox/flox ； Cre+ ，该小鼠所占后代比例为： 1/4 ）和 flox

纯合且 Cre 阴性的对照组小鼠（ geneflox/flox ，该小鼠所占后代比例为： 1/4 ）。

Ø 后续实验（实验组： geneflox/flox ； Cre+ ，对照组：实验组： geneflox/flox ）

为快速获得上述所需小鼠，可将 geneflox/flox ； Cre+ 小鼠与 geneflox/flox 小鼠杂交

l 小鼠基因型鉴定

Ø 小鼠编号原则

Ø Flox 小鼠基因型鉴定（用于鉴定 f lox 纯合、杂合和野生型）

P CR 鉴定引物位置示意图（可选择 P 1,P2 引物对，或 P 3,P4 ， P 1,P4 引物对）

Ø 目的基因组织特异性敲除效果验证

（1） DNA 水平 c re 活性验证

通常是取一小块表达 Cre 的组织，抽提基因组 DNA ，通过 PCR 的方法对 flox 区域进行扩增，

通过 flox 区域的有无，定性判断 Cre 是否发挥作用。

（2） RNA 水平 c re 敲除效率验证

通常是取一小块表达 Cre 的组织，抽提 RNA ，反转录成 cDNA 后，通过 Realtime-PCR 的方 法，

利用 Cre 作用后的 mRNA ，所设计的引物无法扩增出 PCR 产物的原理，定量判断 Cre 作用效率。

（3） 蛋白水平 cre 敲除效率验证

目的组织 western blot 或免疫组化检测。原理：表达 cre 的组织无法检测到目的蛋白。

Ø 动物组织 D NA 抽提

1) 250ul 裂解液 +2.5ul proteinase K(10mg/ml) 直接消化组织，放于 55℃ 恒温热浴过夜

2) 加入同体积（ 250ul ）苯酚：氯仿：异戊醇 混合物（使用前摇晃瓶身混匀） ，上下剧烈震荡 15s ， 12000rpm,15min 常温离心

3) 转移上清于新的 EP 管（期间可能会吸起白色絮状物，无妨）

4) 加入等体积的异丙醇，上下剧烈震荡 15s,12000rpm,15min 常温离心

5) 倒掉上清（也可用真空泵吸，小心底部沉淀），用 75% 乙醇（ 400ul ）， 7500rpm, 5min （可多清洗 2 遍）

6) 将管壁内部及管盖上的残留乙醇吸干，沉淀相对较干，根据不同体积加入 ddH2O

注：因没加 RNA 酶，可能会残余 RNA ， A260/280 会居于 1.9 以上，但 PCR 无妨

lysis buffer 配制（裂解液） ：先加水 500ml ，再加各种成分，最后定容到 1L

l 小鼠饲养及繁殖期间遇到的问题

Q ：小鼠合笼后，很久都不怀孕？

A ：考虑换雌鼠或雄鼠，重新交配

Q ：小鼠合笼后，雄鼠和雌鼠比例及年龄选择？

A ：雄：雌一般 1 ： 2 或 1 ： 3 ，不要太多雌鼠。雄鼠至少 8 w ， 9-10 w 更为合适；而雌鼠一般选择 6 w 及以上。

Q ：什么时候分笼？

A ：大小鼠的哺乳期是 20-22d ， 3 周龄可离乳独立生活，因此出生 3 周后即可将幼鼠与母鼠分开，独立

生活。 视小鼠生长情况，可多哺乳几天。有时为避免笼盒中同时存在两胎幼鼠，导致新生的幼鼠被上

一胎幼鼠踩踏致死的情况，在 19d 左右即可将其分笼。 分笼时需要标记新生小鼠，选择减脚趾，或打

耳钉（耳钉一定要订的足够好，否则后续会被小鼠抓掉）

雌鼠 4 周龄阴腔开张，雄鼠 5 周龄睾丸降落至阴囊，开始形成精子。因此， 4 周龄前一定要进行分笼，

以免发生交配

Q ：母鼠吃仔怎么办？

A ：

1. 雌鼠与雄鼠合笼交配后，雄鼠可以一直与孕鼠一起生活，这样有利于孕鼠整个妊娠过程的稳定

以及仔鼠的出生与哺乳。

2. 怀孕的雌鼠（一般两只）一起生活，或将怀孕及未怀孕的雌鼠在一起。然而，绝对不要在雌鼠

分娩前几天再在笼舍中加入新的雌鼠，这样会打扰到孕鼠以及新生仔鼠；要等仔鼠断奶（ 21 天）

后才能再将雄鼠放入繁殖笼内。

3. 第一胎分娩或太过于年轻的新手母鼠育成仔鼠的成功率比有经验或较为年长的雌鼠要低。仔鼠

出生第一天尽量不要打扰母鼠与幼仔，到第二天母鼠就比较能容忍被打扰的状况了。

4. 若一直持续吃鼠，选择换孕鼠。

Q ：如何准确知道小鼠怀孕天数？

A ：傍晚 5-6 点将雌鼠雄鼠合笼，第二天早晨 8 点检查雌鼠是否有阴道栓（下图所示）。有阴道栓 的

当天中午算为胚胎第 0.5 天。检栓后，未见到栓的雌雄鼠分开，至下午再进行合笼。不过，观察 到

阴道栓只能说明发生了交配行为，并不能完全作为怀孕的标志，见到栓以后仍可能发生未怀孕的情况。

小鼠表型观测参考点：体型差异、毛发、体重、活动能力，最关键还是要结合敲除或敲入基因的具体功能

常见的肝癌模型

1. 诱发性肝癌模型： D EN, DEN+CCl4 ， HFD+CD+CCl4

2. 移植性肝癌模型：异位移植即皮下成瘤，原位移植（肝脏，经脾脏）

3. 基因敲除鼠（如 H BV-TG, PTEN, APC, miR-122 肝特异性敲除 , Myc 肝特异性过表达）

4. 高压尾静脉 H TVI

诱发性肝癌模型

Treatment ( Intraperitoneal injection)	Mouse strain	Age	Post-Intrasplenic inoculation (#tumor/# total mice)
20mg/kg DEN	C57BL-male	12day	8 month -8. 5month
20mg/kg DEN	C57BL-female	12day	9 month -10 month

l D EN

l D EN+CCl4

20mg/kg DEN, injected at day 12 of C57BL mice.

1ul/g of 20% of CCL4 (diluted by Olive), start from week 4 of mice, once a week, for 14-18 weeks (Male-16week, female -17 week)

移植性肝癌模型

l 皮下成瘤 subcutaneous tumor formation

注意点

（1） 肿瘤细胞系选择

（2） 小鼠品系选择： N ude, NOD/SCID, NSG

（3） 接种部位：腋下、腹股沟、侧腹部及颈背部（血管丰富且易操作部位）

操作步骤

（1） 肿瘤细胞的传代扩增

确保肿瘤细胞的活力和良好的生长状态

（病毒感染可选择再传代扩增；若 s iRNA 或质粒转染处理细胞不建议传代扩增，质粒转染 24 小时，保证

最大效率。 siRNA 取决于平时做实验的经验 。）

（ 2 ） 计算细胞接种量

结合文献来确定细胞接种量，在找不到相关资料的情况下，最高就用到 1000 万 /0.1ml ，不可再高（因为 细胞

悬液已达饱和状态）。并且提前计算确定细胞数量，一般注射 40 只小鼠，至少需要准备 50 只小鼠的细胞量。

（ 3 ） 准备裸鼠

一般选择 5-6W 裸鼠，小于 4W 动物可能不耐受而过早死亡，大于 6W 免疫力会增强，不 易成瘤；雌雄均可

（ 4 ） 操作 步骤

① 预准备： matrigel 4 ℃过夜融化，若 1 人操作可选择使用呼吸麻醉仪，去鼠房前可考虑打一盒冰和带上移

液器和枪头，用注射器不好重悬细胞

② 接种时选择好部位进针，建议接种前酒精棉球擦拭消毒进针位置 （实验室选择以后腿股） ；

③ 向前方穿行，注射前针头稍微动一动，能动说明在皮下，否则可能在皮内或者肌肉内；

④ 针头在皮下走一段再注射，速度不可太快，一般体积为 100-200μL （ PBS 或者无血清培养基稀释细胞，

若不易成瘤可添加 matrigel 促进成瘤），可看见明显的鼓包；

⑤ 接种点离进针点尽量较远，减少漏液和污染的可能；

⑥ 注射完毕后，缓慢 旋转 退出针头 （ Z 字型扭） ，尽量避免漏液；

⑦ 细胞需一直置于冰上，使细胞处于比较低的代谢状态，一般 2h 之内不会有问题。

（ 5 ）后续实验安排

① 分组：一般来说皮下荷瘤主要用于抗肿瘤药物的检测，因此我们一般分为对照组，阳性药物组，

低剂量、中剂量及高剂量药物组等；

② 数量：荷瘤时每组不少于 10 只，考虑到小鼠成瘤率和死亡原因，最终实验应至少可以获取 6 个有效 数据；

③ 给药时间：一般接种 7-10 天后便可看到肿瘤长起，便可分组实验（鼠源细胞系会更快）；

④ 人道终点：动物伦理学规定，小鼠肿瘤重量不可超过小鼠体重 10% ，平均肿瘤直径 不超过 20mm ，

并且如果出现溃烂，造成感染或坏死时，应该中止实验且对动物施行安乐死。

（参考资料： http://www.bioraylab.com/knowinfo/17.html ）

参考剂量和处理时间

C ell line	M ouse strain	A ge	HCC formation
Huh7 cell (10 6 /flank,100ul PBS+ 100ul matrigel )	BALB/c nude mice ( Male)	5 w	1 8day(first), 25day (almost)
Huh7 cell (10 6 /flank,100ul DMEM+ 100ul matrigel )	BALB/c nude mice ( Male)	5 w	1 4day(first), 20day (almost)
HLE cell ( 5* 10 6 /flank,100ul PBS+ 100ul matrigel )	BALB/c nude mice ( Male)	5 w	×
Huh7 cell ( 8* 10 5 /flank,100ul PBS+ 100ul matrigel )	BALB/c nude mice ( Male)	5 w	1 4day(first)
RBE cell ( 8* 10 5 /flank,100ul PBS+ 100ul matrigel )	BALB/c nude mice ( Male)	5 w	1 4day(first)
HUCCT1 cell ( 8* 10 5 /flank,100ul PBS+ 100ul matrigel )	BALB/c nude mice ( Male)	5 w	1 4day(first)
Huh7 cell EpCAM+(Top8%) ( 5* 10 4 /flank,100ul DMEM+ 100ul matrigel )	Nod SCID ( Male)	5 w	20day(first), 25day (almost)
Huh7 cell CD133+(Top8%) ( 5* 10 4 /flank,100ul DMEM+ 100ul matrigel )	Nod SCID ( Male)	5 w	15 day(first), 20day (almost)

l 经脾脏注射肝癌细胞 Intrasplenic inoculation

操作步骤：

预准备：麻醉剂 2% 戊巴比妥钠 配置 (100ml 0.9% 的生理盐水中含有 2g 戊巴比妥钠，用 0.22um 过滤器除菌 ) 。

加热 垫、止血钳、 prolene 线

1. 腹腔注射麻醉剂（ 剂量 、 /kg ， 如 小鼠 体重 20g ，注射 100ul ） ）

2. 将麻醉状态的小鼠侧躺（我们的左侧），有毛的老鼠需剃毛。在前肢与后肢中线靠后肢 1/3 处，用 75% 酒

精棉擦拭，观察到暗色的脾脏。

3. 左手用弯头镊提起皮肤，右手操作眼科剪（弯头朝内）剪开小鼠的皮肤，再用镊子提起皮肤下的肌肉

组织，剪开，此时观察到鲜红色的脾脏，用镊子轻轻将脾脏提出，靠近下缘 2mm 位置，针面朝上，慢慢

推入的已备好剂量的细胞，可见脾脏被膜肿胀，颜色变稍白。

4. 脾脏下缘和上缘各有一条血管，中间无组织粘连，此时左手用镊子夹住这个没有血管和组织的脾脏，

轻轻提起，能明显观察到血管，然后用电凝笔，靠近脾脏将连接的血管和有些许胰腺功能的组织切割

下来，观察切割下来的组织血管是否出血（最好用电凝笔再止血）当电凝笔不能止血时，立刻用止血

钳夹住出血位置，在贴近止血钳下方用缝合线结扎止血（剪线时留，小于 2mm 线头）。用镊子轻轻将

脾脏稍微往外拉出，观察到上缘的血管，同下缘脾脏血管操作。

5. 用镊子提起肌肉组织，此时胰腺较容易重回腹腔。左手用镊子夹住肌肉和皮肤，右手拿缝合针（用离

持针器前 2mm 位置夹住缝合针）穿过一侧皮肤和肌肉，在将另一侧的肌肉和皮肉夹起，缝合针穿透时，

打开持针器，左手的镊子顺着针的弧度将针拔出（右手的持针器可辅助稳定老鼠）。靠左 4-0# 丝线绕靠

右的持针器一圈，持针器夹住另一端线头，打结。同操作打第二个结，剪线。用浸有生理盐水的棉花，

擦拭伤口周围血渍。

6. 将小鼠趴卧，再用拇指和食指捏住小鼠颈部皮肤，并轻提，右手持注射器将针头插到皮下，注射 1ml

生理盐水（防止脱水）。如果注射后出现皮肤起包，则注射到了皮内。（一般情况下，两个手指可以

感觉到针头的位置，可以确定针头是否在皮下）。

7. 将脾脏注射后的小鼠放置在加温垫的鼠盒上，以维持其体温。

8. 注射后第二天观察小鼠的行为活动，生命体征。

（参考资料：妮娅师姐整理）

C ell line	BALB/c nude mice	Post-Intrasplenic inoculation (#tumor/# total mice)
Huh 7 -ctrl, miR192KO cell (10 6 )	Male-4w	8 w (6 / 12 outside of liver, 2/12 intra-hepatic)

l 肝脏原位注射肝癌细胞 Intra he patic transplantation

操作步骤

（ 1 ）用 50% 基质胶重悬细胞，小鼠 （选用 N ude mice ） 10 ⁶ 个 /20 -30 ul PBS 体系

（ 2 ）麻醉小鼠：戊巴比妥钠，麻醉后绑定 （可用医用胶布）

（ 3 ）剃毛后沿腹中线切开皮肤，长度 3cm 左右，露出剑状软骨，将切口撑开

（ 4 ）先用棉签使用生理盐水浸润，然后将肝左叶（最大的一叶）用棉签挑起

（ 5 ）缓慢注射 20ul 细胞悬液，注射后停留 5s ，旋转退出针头，避免细胞回流。注射成功后在肝脏部

位一般能看见白色突起

（ 6 ）注射完毕后消毒腹腔，然后缝合伤口

（参考资料： Nat Protoc. 2015 Aug;10(8):1264-74. ）

参考剂量：

C ell line	C57BL	Post-Intrasplenic inoculation (#tumor/# total mice)
Huh 7 -ctrl, miR192KO cell (10 6 cell /30 ul PBS)	Male-4w	1month 无肉眼可见结节

高压尾静脉 H TVI

l S leeping beauty system

注意点

(1) Plasmid of SB: plasmid of gene X=1:10 ~1:25

(2) Time for injection: 5-9 seconds

(3) Buffer: salin (10% mice body weight)

(4) 选用小鼠最好一批出生，要设置的对照和实验组同一天注射

操作步骤

预准备：所用溶剂可为生理盐水或 R inger’s buffer （ 1 L 溶液中含 0.42g KCl , 9.00g NaCl , 0.24g CaCl2 , 0.2g NaHCO3 ）

1. 将小鼠固定，用呼吸麻醉仪持续让小鼠吸入异氟烷

2. 用热水浸湿纸巾捂热小鼠尾巴，使静脉扩张，紧靠白色尾骨两侧有清晰可见的 2 根红色静脉

3. 用左手的食指、中指、无名指及大拇指将小鼠尾巴固定。手法：握住 1 ml 注射器前面 0 .1mL 处，右

手小指搭在拽着鼠尾的左手拇指处，按此手形进针

4. 注射时左手扯尾，使尾巴紧贴桌面，一般选择距尾尖 1/4 或 1/3 处进针，此处皮肤较薄，血管清晰，

进针容易。将欲注射的鼠尾用左手紧紧压在桌面上，右手进针时针头与桌面平行，针尖稍稍朝下，一

旦进入，将针头稍稍上挑进入，针头沿血管进入，肉眼可观察到针头前进。如果针头在血管中前进，

可明显地感觉到针行通畅，毫无阻力。若针头不在血管中，手感针行有阻力。进针时不要太深，针头

入皮肤后马上把针头略往上，平行进针，针扎入时有落空感，推液时无阻力则说明成功了。如果推液

阻力较大，甚至注射处出现渗液，则说明不在静脉内，需要重新调整注射。

5. 注射结束后，用医用棉花止血。可能会出现小鼠心跳骤停，采用挤按心脏部位复苏，密切观察。

注射成功特点：注射到静脉的推液几乎没有阻力，可快速将液体推完。 如果注射到静脉以外，强行

推液，阻力较大，注射处周围会出现露水样渗液，而且出针后，出血较少。并且由于药液瘀阻在尾

部，导致血流不畅，尾部缺血，易导致尾部炎症和坏死。

参考剂量

G ene X	C 57BL mouse Ages	plasmid	Post-injection (#tumor/# total mice)
c -myc	Male-4w	20ug c-Myc/pT3EF1a + 2ug SB in 1.5mL	8 w ( 1/6), 12w ( 1/8)
c myc+ MCLI	Male-7w	2ugMyc/pT3EF1a+2ugMCLI/pT3EF1a+0.3ug SB	8 w (no nodule)
NRasV12+myr-AKT	Male-4w	5ug Ras/pT3EF1a +5ug Akt/pT3EF1a +0.67ug SB in 1.5mL	5 w (5 / 5 )
NRasV12+myr-AKT	Male-6w	1. 5ug Ras/pT3EF1a + 1. 5ug Akt/pT3EF1a +0. 2 ug SB in 2 mL	8 w ( small nodule)

G ene X	FVB/N mouse Ages	plasmid	Post-injection (#tumor/# total mice)
c -myc	Male-4w	20ug c-Myc/pT3EF1a + 2ug SB in 1.5mL	8 w ( 1/6), 12w ( 1/8)
NRasV12+myr-AKT	Male-4w	5ug Ras/pT3EF1a +5ug Akt/pT3EF1a +0.67ug SB in 1.5mL	5 w (5 / 5 )

实验室内部交流问题和解答

1. 当 DNA 分子上存在两个方向相反的 loxP 序列时， Cre 可导致 loxP 之间的序列发生反转 ，那么 序列反转的后果是什么呢？如果是让这段序列失去功能的话，也相当于敲除吗？

解答：序列反转指的是目标序列的倒位 ，的确失去功能，但应该不算敲除，因为那一段不知道会发生什么作用。

2. 两个 loxp 之间基因的大小如果会影响敲除效率 ， 那么基因大小的可能极限是？

解答：现已发现两个因素会影响 Cre-lox 重组的效率。第一个因素是 lox 序列中不对称区段的碱基序列 。第二个影响因素是一对 lox 序列之间 floxed 序列的长度， Cre-lox 重组的效率随着其长度的增大而降低，或许是因为反应动力学的影响。 根据这篇文献，（ PLoS One. 2009; 4(1): e4200 ）建议最长为 13 kb 。

且 Cre 重组酶在不同物种或者同一物种的不同类型细胞或组织中介导 lox 位点发生重组的效率差异较大 , 目前对导致这种现象产 生 的内在机理不清楚 , 有文献推测这可能是由于 Cre 重组酶对处于不同类型细胞和不同发育时期的染色质中 lox 位点的识别能力不同 所致。

（参考资料：维基百科）

3. Cre 鼠不能鉴定纯合杂合的 原因？

解答：判断小鼠是否为 cre, 用 PCR 判断只能说有 这个 酶，有可能是 cre+/+,cre+/-, 然后用同为 cre 阳性的 2 个鼠去杂交，如果后代一直稳定为 cre ，则上述 2 只大概率为 cre+/+ 。

4. Cre 酶 可以发挥效应去切割 loxp 的是吗？然后切割完 loxp 两侧的序列还是连接上的吗？

解答： Cre 酶作用后，切除部分为两个同向 Loxp 位点中间的部分和其中一个 Loxp 位点，在 DNA 酶的作用下发生环化，剩下部分相连。

5. 当两个 loxp 位点方向相同的时候 Cre 可将两个 loxP 序列之间的 DNA 片段切出并环化，那环化的这个片段会对小鼠有影响吗 ？

解答：留下那段环化的 loxp 序列，因为体内有 DNA 酶，不受保护，会被降解掉， 对体内 不会有太大影响 。

6. 如果需要检 cre 的敲除效果，一般取的是什么组织呢？ 能和基因型鉴定一样用鼠尾吗？

解答： 检测 Cre 的敲检效率需使用条件性敲除的脏器组织（如我们实验室使用的是肝脏）。一般在最初建立品系时会检测一次，从蛋白和 RNA 的水平（如果是 miRNA 只能是 RNA 水平），确定确实已经敲除。在完成实验小鼠死亡后，再次取肝脏组织鉴定敲除效率。 如果是全身性敲除的话，鼠尾鉴定是可以从基因组上看出来的，那一段是缺失的。

7. 亲本可用 Cre ， loxp 纯阳性替代吗？

解答： cre 是杂合或纯和都会显示 cre 阳性，而 loxp 最早公司提供给你的就是 loxp+/-, 等后续拿到纯和，需要大批量实验组的时候，可以采取均纯阳性。但推荐有杂合的继续进行繁殖。

8. 鼠尾基因型 鉴定一般进行几次？

解答： 鼠尾基因型鉴定一般在小鼠分笼时和小鼠死亡后各做一次 。

9. 实验室所用 N ASH 的模型

解答： DEN+HFCD ， 12 天 DEN 20mg/kg, HFCD 三周开始喂食， 27 周有小 结节形成 。

10. 如果是质粒或 siRNA 处理细胞去做皮下成瘤，一般细胞处理多久呢？ 会取一部分再做个鉴定吗，比如有没有过表达或者敲减？

解答：留一部分细胞做检验，质粒转染 24 小时，保证最大效率。 siRNA 取决于平时做实验的经验 ，若 24 h 有效果即可收细胞皮下注射。病毒加足够量确保过表达或敲减，可以再细胞传代的。

11. 选择皮下成瘤的细胞系？

解答：常见有 HepG2\SMMC-7721\Huh7\Hep3B\HCCLM3 。不推荐 H epG2 ，需要剂量太大且细胞堆叠生长。

12. 皮下注射、肝脏原位注射、脾脏注射产生的肿瘤有什么区别？该怎样判断应该选择哪一种注射方式进行实验？

解答：皮下成瘤的优点：成瘤率高，周期短，肿瘤的大小和位置较易控制，个体差异小，另外，对宿主的影响类似，易于客观判断疗效。缺点：缺乏肿瘤微环境的影响，该模型不能很准确模拟肿瘤细胞在体内生长。

原位移植（经脾脏或肝脏原位注射）的优点： 原位生长能更好的模拟肿瘤细胞在体内生长的微环境，药物疗效预测更加精准。 缺点： 外科移植手术程序复杂且价格昂贵，另外，难于快速检测肿瘤生长及其对药物的反应。

13. 体外成瘤和体内成瘤的细胞系有特殊明显的差异吗？对体内或者皮下成瘤的小鼠在细胞系的选择上有什么要求？

解答：关于皮下成瘤，反应细胞恶性表型主要是增殖和干性， HLE 不成瘤很大一个原因是它悬浮小球能力就不好，无法聚成块。原位注射主要反应这个细胞在某种微环境中 汲取 营养和自我适应的能力。这些都需要考虑细胞系在体外实验中如增殖、转移等能力 。

14. 高压尾静脉注射的话 , 其他脏器会收到影响吗？

解答：根据高压尾静脉的原理，快速将大体积的溶液注射入小鼠尾静脉导致注射溶液在下腔静脉的大量积累，而心脏在短时间内是无法将如此大量的溶液从静脉运输到动脉完成循环的。所以，在下腔静脉就产生了一个很高的静脉压力，从而使肝门静脉的血液倒流，注射的溶液也随即流入肝门静脉。由于肝脏中的血管与肝门静脉相连，注射的溶液于是流入肝脏中且压力很大，迫使肝循环中的血液倒流至毛细血管出口（和微静脉之间）。由于高压的结果，肝窦的孔径增大，肝细胞产生穿孔，膜通透性增加，所以外源大分子就被被压入肝细胞。再过一段时间，细胞膜重新闭合，于是外源大分子就保留在肝细胞，一部分还会进入细胞核。如果转染真核表达质粒，可在其中瞬时表达。可用于转染的大分子有质粒 DNA 、寡聚核苷酸人工染色体、 mRNA 、 tRNA 、 rRNA 、 siRNA 、病毒 RNA 、蛋白等 。

上述可看出主要影响肝脏，但也有文献表明对心脏、肾脏、脾脏均有影响，但不及对肝脏影响的 0 .1% 。

15. 高压尾静脉注射实验中，麻醉小鼠后对鼠尾进行高温处理，使静脉扩张，便于观察和注射。可使用呼吸麻醉仪进行实验。高压尾静脉使用的质粒系统为 Sleeping beauty ，如想扩增某基因 /RNA 等，将片段构建于 pT3 - EF 1 α 质粒上，按比例搭配注射。

16. 高压尾静脉模型的转座子选择是 pb 还是 sb 有区别吗？是鼠对这个系统有差异还是它们有效率差异？

解答：可根据实验需要，选择合适模型。

相同点： Sleeping Beauty(SB) 和 P iggyBac （ P B ）

均为转座子，两者均需要转座酶合成基因 + 能够被转座酶识别的具有反向重复序列的转座元件。

两者转座机制均为剪切、粘贴的 D NA 转座模式

不同点：

P iggyBac （ P B ）	Sleeping Beauty(SB)
PB 比 S B 有更高转座效率	S B 更容易插入到供体附近，具有近距离转座的偏好性
SB 转座后会留下 C AG 的 3 个 b p 足迹，而 P B 转座后供体位置不会留下任何序列改变
常用为 I CR 小鼠	常用为 F VB/N 小鼠
癌基因如 YAP-5SA active mutant 注射，需 3-4 个月成瘤；但 2 种及以上质粒混打成瘤加快但至少 2 个月。	根据上文总结，一般成瘤小于 2 个月

附件： 3.小鼠实验（条件性敲除，肝癌模型）.docx