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我们开发了自动计算机视觉软件，以检测以pH敏感荧光探头为标志的外细胞事件。在这里，我们演示了使用图形用户界面和 RStudio 来检测聚变事件、分析和显示聚变空间参数，并将事件分类为不同的聚变模式。

外分泌软件的自动检测和分析将允许用户自动检测外阴事件和PH敏感荧光的TIRF图像序列。它还将自动输出外来体的特征，如空间分布或频率，以及外来事件的个别特性，如半衰期或背景荧光变化。此外，还包括一个选项，将外阴事件分类为四种外细胞出征模式，以前在文献中描述过。

为了使用 Exocytosis 软件的自动检测和分析，首先您将单击查找数据集按钮，然后导航到数据沉积的位置，并且需要放入一个名为原始数据的文件夹。您的数据文件将在此处自动填充列表，并且您可以在此文件夹中包含任意数量的数据文件。接下来，您需要选择一个目录，用于存放您的分析文件。

在这里，我选择了一个叫做测试的目录。您还需要填写图像的帧速率以及像素大小。在这里，我的帧速率是每帧一百毫秒，我的像素大小是八纳米。

最后，您将需要掩码文件，以便运行外阴的自动检测和分析软件。您可以使用包含的掩码制造商按钮，以便从数据文件中自动生成掩码文件。运行指示器将变黄，然后在面罩制造商完成运行后返回绿色。

您的面具将存放在您所选目录中称为"掩码文件"的新文件夹中。请注意，掩码文件将自动填充此处的列表。您将希望检查您的掩码文件是否适合为您的数据文件制作，并且您可以通过突出显示列表中的任何数据文件以及相应的掩码文件来做到这一点。

数据文件的第一帧将显示，选择的掩码文件也将显示出来。这里。我们可以看到，我们的掩码文件适合手头的分析。用户也可以单独提供掩码文件。

当一个人希望从当前数据文件中制作一个掩码文件时，我们建议使用"图像 J.In"来完成，请首先打开您希望从图像 J 中制作掩码文件的图像。然后，您可以使用多边形选择工具，通过单击单元格边缘开始创建周围掩码文件。完成面罩后，请双击以连接到整个多边形。

完成后，您将前往编辑、选择和创建掩码。将创建一个倒置的面膜。您将希望使用与数据文件相同的名称保存此掩码文件，然后_mask_file。

现在，如果您提供自己的自定义掩码文件，请务必让自动检测软件知道这些掩码文件的位置。为此，您将单击查找的掩码文件按钮，并在其中导航到包含其掩码文件的目录。然后，新的掩码文件将在此处填充列表。

在进行分析之前，您必须为每个数据文件提供一个掩码。现在，一旦您加载了数据集、掩码文件、帧速率和像素大小进行了正确调整，以及选定的目录，您最终可以决定是否要将分类作为分析的一部分。如果切换分类按钮，除了检测外阴事件外，每个外阴事件将被分为四个类别之一。

一旦您确定了分析的运行方式，则可以通过单击分析按钮开始分析。运行指示器将变为黄色，以指示分析正在进行中，并在分析完成后返回绿色。一旦分析完成，如您的运行指示器从黄色更改为绿色所示，您就会注意到您所选目录中出现了一个新的数据文件文件夹。

在数据文件文件夹中，您会发现与分析运行中设置的每个图像对应的分析文件。此外，这里还包含包含汇总信息的单元格统计文件，例如每个图像集的外阴频率。对于每个图像集，您都有一个荧光痕迹文件，其中包含有关 X 位置、Y 位置和帧号的信息，用于它们发生外细胞事件的位置。

此外，在外阴病发生之前、期间和之后，每个外分泌事件周围感兴趣的区域的平均荧光都呈现在外分泌之前、期间和之后。此外，还有一个跟踪文件，其中包含 X、Y 和时间位置的类似信息。但是，如果检查分类复选框，此外，还会有四个额外的列，表示属于四个类别之一的外阴事件的概率。

要么全囊泡融合瞬间，全囊融合延迟，亲吻和运行瞬间，或亲吻和运行延迟。如果外泄事件大于 0.5，则属于四个类别之一，并且是所管辖的四个类别中的最高概率。在这种情况下，这里的第一个外阴事件属于全囊泡融合瞬时类，因为它是四个类以上的最高数字，大于 0.5。

此外，每个图像集还有其他一些功能文件，这些文件在外阴分类期间使用，并可能有兴趣作进一步分析。最后，如果我们想要使用Ripley的K分析来检测外延的时空组织，我们将首先将我们的面膜文件拆分为一个神经质的掩膜文件和一个索马面膜文件。我们将首先在 Image J 中打开我们的面罩，以便使用选色器来选择背景像素。

这样，当我们填写掩码文件时，它是正确的值。接下来，我们将使用多边形选择工具，并勾勒出体面区域。现在这需要一点主观的、手动的决策。

我们建议一个粗糙的椭圆形。完成后，您将开始编辑、选择和创建掩码。最后，您将回到我们原来的面具文件，并使用编辑和填充来填写索马，现在我们有一个单独的神经质和索玛面膜文件，然后您将保存。

一旦你保存了你单独的神经质和索玛面膜文件，在这里，我有它作为面具文件下划线神经和下划线索马，我们将来到MATLAB，并打开神经质2D网络MATLAB文件。在这里，我们将将当前文件夹导航到我们的目录，在那里我们存入了所有分析数据。一旦我们做到了这一点，我们将改变面具名称路径到我们的新面具文件，这是神经质。

因此，在这种情况下，我有我的神经质面具文件下的面具文件文件夹。然后，我们将更改 CSV 文件名，更改到荧光痕迹文件的位置。在这种情况下，它仍然在数据文件夹中，因此数据文件斜线和荧光跟踪CSV文件的名称。

一旦完成，然后你可以点击运行。然后，这将创建一个骨架版本的神经质掩码文件，并将其作为一个CSV文件下的掩码文件夹，我们可以在这里看到。接下来，我们将生成一个CSV文件为索马以及。

为此，打开CSV掩码创建者文件。您需要为您的 Soma 面罩和创建 CSV 文件的名称提供路径。在这里， 我只是继续前进， 并使用相同的文件名称， 只是与点 Csv 附加。

点击运行，你会看到一个新的索玛CSV文件已经创建旁边的神经质。一旦我们为神经质面膜和索玛面膜创建了CSV文件，我们就可以运行Ripley的K分析。为此，我们将导航到 R 工作室并打开 Ripley 的 K 分析 R 文件。

这里有两个主要变量需要注意，神经元面膜和神经元数据点。神经元掩码将指向任何您想要运行的掩码文件。在这种情况下，我首先运行索马面具文件。

您将希望运行所有索马掩码文件与所有神经质掩码文件分开。在这里，我有两个神经元，我将用于这个分析。但是，您可以使用尽可能多的，你想为Ripley的K分析，你只是想复制和粘贴这个代码的神经元面膜，并改变变量为三，然后继续。

第二个变量是神经元数据点。在这里，您想将其指向由您的功能生成的所有提取的 R 文件的文件。现在我的被命名为融合统计， 所以这就是它在这里读到的。

如前所述，我有第二个索马面具文件和神经元，这是一起分析，以便我们可以聚合里普利的K在一起。一旦您将这些路径更改为正确的路径，您将使用代码、运行区域并运行所有路径。运行完成后，将生成多个图集，包括分组 Ripley 的 K 值以及密度图。

这些可以通过去出口，保存图像作为和选择适当的图像格式，目录，文件名称，最后点击保存保存。在这里，我们看到来自12个穆林皮质神经元的代表结果，这些神经元使用TIRF显微镜在两天内对氟进行成像。在A中，我们看到异细胞增多的频率除以阶级。

在这里，我们可以看到，全囊融合瞬时发生比其他类更频繁。在 B 中，我们可以看到模式分布，确认全囊泡融合瞬时占所有事件的一半以上。在C中，我们确定外来社会空间分布作为热图。

我们可以看到，大多数外阴事件都聚集在索马附近的热点，以及中性星的远端。在 D 中，我们可以确定外阴事件在统计学上显著聚类，并且这些聚类的大小范围从半微米到一微米大小不等。使用自动分析程序以公正的方式正确识别和分析外阴事件，可提高分析效率，并提高可重复性和严谨性。

为了确保检测的准确性，在成像过程中保持高信号对噪声非常重要。捕捉外显子事件或其他pH敏感的瞬态事件需要足够快的成像频率来捕捉所有事件并改善估计，如荧光的半衰期或峰值变化。我们已经证明，这个程序不仅能准确地捕捉发育中的神经元中的pH感应荧光，而且还能准确捕获其他细胞类型。

但是，如果使用另一种细胞类型，则必须检查准确性差异，因为其他细胞类型中瞬态事件的不同行为。到目前为止，这种分类只用于开发神经元。事实上，我们不知道这些过程存在于其他细胞类型或在神经元的后期发育时间点。

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