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单分子Förster共振能量转移(smFRET)是一种多功能技术,可报告亚纳米到纳米范围内的距离。它已被广泛用于生物物理和分子生物学实验,包括分子力的测量,生物分子构象动力学的表征,蛋白质细胞内共定位的观察以及受体 - 配体相互作用时间的测定。在宽视场显微镜配置中,实验通常使用表面固定探针进行。在这里,提出了一种将单分子跟踪与交替激发(ALEX)smFRET实验相结合的方法,允许在质膜或玻璃支持的脂质双层中获取表面结合但移动探针的smFRET时间痕迹。为了分析记录的数据,开发了一个自动化的开源软件集合,支持(i)荧光信号的定位,(ii)单颗粒跟踪,(iii)确定与FRET相关的量,包括校正因子,(iv)严格验证smFRET痕量,以及(v)直观地呈现结果。生成的数据可以方便地用作通过专用软件进一步探索的输入,例如,用于评估探针的扩散行为或研究FRET跃迁。
Förster共振能量转移(FRET)一直是分子生物学和生物物理研究的主要驱动力,因为它允许以亚纳米分辨率研究过程。由于供体和受体荧光团之间的能量转移效率很大程度上取决于亚纳米至纳米范围内的染料间距离,因此已有效地将其用作光谱标尺来探索生物分子的静态和动态构象 1 , 2 , 3 , 4 。此外,FRET现象已被广泛用于膜相关和细胞内蛋白质的体积水平的共定位研究 5 , 6 。在过去的二十年中,该方法被应用于监测smFRET事件 7 ,这有助于显着提高时间和空间分辨率,甚至解决了异质样品中罕见的亚群。利用这些技术,对RNA聚合酶 II8 的转录本处理速率、DNA聚合酶的复制速度 9 、 10 、核小体易位率 11 、组装剪接体的转录本剪接和停滞率 12 、核糖体亚群的活性 13 、驱动蛋白马达的行走速度等分子机制的动力学有了独特的见解 。 ,仅举几例。受体-配体相互作用持续时间 15 和分子力 16 已被量化。
基于强度的smFRET研究通常依靠敏化发射来测量FRET效率:发射路径中的分束器在空间上将来自供体和受体荧光团的光分离,在供体激发时,允许量化单个荧光强度。随后,效率可以计算为受体发射的光子相对于总光子计数 的分数17 。此外,供体激发(ALEX)后的受体激发允许测量FRET事件的化学计量,有助于区分来自信号的真正低FRET信号,例如,来自具有光漂白受体荧光团的探针 18 。
单分子FRET实验通常以两种方式之一进行。首先,使用共聚焦显微镜照亮样品体积中的一个小区域。溶液中的单个探针分子碰巧在焦点体积内扩散时会被激发。通过这种技术,可以使用快速光子计数探测器,从而实现亚微秒级的时间分辨率。其次,探针专门固定在表面上,并通过宽视场显微镜进行监测,通常使用全内反射(TIR)配置来最大限度地减少背景荧光。探头固定允许比使用第一种方法更长的记录时间。此外,更大的视野允许并行监控多个探头。与上述方法相比,对相机的需求使得此方法速度较慢。时间分辨率限制为毫秒到秒的范围。
如果需要较长的时间迹线,例如,用于在毫秒到第二时间尺度上研究动态过程,则第一种方法不适用,因为荧光爆发通常太短。当固定不可行时,第二种方法就会失败,例如,在具有探针在细胞膜内扩散的活细胞实验中。此外,已经观察到生物模型系统可以根据接触表面的迁移率而显着改变其响应 16 。
虽然过去已经进行了记录移动FRET探针的smFRET和单粒子跟踪实验组合 19 ,但没有公开可用的软件来评估数据。这促使了一种新的分析平台的开发,该平台允许确定移动荧光探针的多种特性,包括smFRET效率和化学计量,具有亚像素精度的位置以及作为时间函数的荧光强度。建立了通过检查逐步漂白行为,最近邻距离,发射强度和其他性状来过滤所得痕迹的方法,以专门选择正确合成和功能性的单探针分子。该软件还支持最近在多实验室研究中商定的实验和分析技术,以产生可靠,定量的smFRET数据 17 。特别是,该实现遵循了计算FRET效率和化学计量的经过验证的程序。供体发射 通道 IDD 和受体发射通道 IDA 中供体激发时的荧光强度用于使用方程( 1 )计算视在FRET效率 Eapp 。
( 1 )
在受体激发 IAA 时受体发射通道中的荧光强度的帮助下,使用Eq( 2 )计算表观化学计量。
( 二 )
FRET效率 E 和化学计量 学S 可以通过考虑四个校正因子从 Eapp 和 Sapp 推导出来。
α描述了供体荧光泄漏到受体发射通道中,并且可以使用仅包含供体荧光团的样品或通过分析受体已被漂白的部分轨迹来确定。δ校正供体激发光源对受体的直接激发,并且可以使用仅具有受体荧光团的样品或通过分析供体已被漂白的部分轨迹来测量。
γ对 IDD 进行分级,以纠正供体和受体发射通道中的不同检测效率以及荧光团的不同量子效率。该因子可以通过分析受体漂白时在具有高FRET效率的轨迹中白化时供体强度的增加来计算 20 ,或者通过研究具有多个离散FRET状态的样品。
β 对 IAA 进行缩放,以校正供体和受体激发的不同效率。如果通过受体漂白分析确定 γ ,则可以从已知供体与受体比率的样本中计算 出β 21 。否则,多态FRET样品也会产生 β 。
总之,校正允许使用等式( 3 )计算校正后的FRET效率。
( 3 )
以及使用Eq( 4 )校正的化学计量。
( 4 )
理想情况下,供体与受体比为1:1的校正化学计量学给出 S = 0.5。在实践中,降低的信噪比会产生 S 测量值的扩散,从而阻碍了仅供体信号( S = 1)和仅受体信号( S = 0)的区分。由此产生的时间轨迹可用作对单分子轨迹进行更详细分析的输入,以获得诸如时空力分布 16 、单分子事件的迁移率 22 或不同状态之间的过渡动力学 等信息1 。
以下协议描述了smFRET跟踪实验的实验参数和程序,以及使用新开发的软件套件进行数据分析的工作原理。对于实验数据的获取,建议使用符合以下要求的显微镜设置:i)检测单染料分子发射的能力;ii)宽视场照明:特别是对于活细胞实验,建议使用全内反射( TIR23 , 24 , 25 )配置;iii)根据波长对发射光进行空间分离,以便供体和受体荧光投射到同一相机芯片 25 或不同相机的不同区域;iv)以毫秒级精度调制供体和受体激发的光源,例如,使用可直接调制的激光器或通过声光调制器进行调制。这允许频闪照明,以最大限度地减少荧光团的光漂白以及交替激发以确定化学计量;v) 每个记录的图像序列输出一个文件,格式可由 PIMS Python 包 读取26 。特别是,支持多页 TIFF 文件。
1. 软件先决条件
2. 样品测量
图 1
:图像采集。
(
A
) 激励顺序。在使用405 nm激光器记录染料加载电池的可选图像后,供体和受体分别使用532 nm和640 nm激光器交替和重复激发照
度时间
。
供体和受体激发之间的时间
TR
必须足够长,以便相机读取图像。延迟时间
tdelay
可用于调整采集帧速率,从而调整光漂白前的观察时间跨度。此面板从
16 修改而来
。(
B
)基准标记用于计算两个发射通道之间的坐标变换。匹配的基准点由颜色表示。应记录几个偏移的图像,以确保覆盖整个视野。(
C
)使用密集标记的样品记录用于平场校正的激光轮廓。记录和光漂白受体配置文件,然后获取供体配置文件。应在不同的样品区域拍摄多张图像,进行平均和平滑处理,以减轻样品缺陷(例如,图像中顶部的亮点)的影响。(
D
)平场校正图
p
(
x,y
)根据
C
中描述的记录的20个激光轮廓计算得出。缩写:FRET = Förster 共振能量转移;
ImDD
= 供体激发时的供体发射图像;
ImDA
= 供体激发时的受体发射图像;
ImAA
= 供体激发时的受体发射图像。比例尺 = 5 μm。
请单击此处查看此图的放大版本。
3. 用于确定校正因子的附加测量
4. 单分子定位算法
注意:几个分析步骤需要单分子定位。在高斯拟合算法 30 和质心计算 31 之间进行选择,具体取决于信号密度、背景和信噪比。
5. 软件初始化
图 2
:典型分析管道概述。
请注意,滤波步骤会根据实验设计进行调整。此数字是从
16
修改而来的。缩写:FRET = Förster 共振能量转移。
请点击此处查看此图的放大版本。
注:试用该软件的示例数据可从 https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files
6. 单分子的定位、跟踪和荧光强度分析(01.Tracking.ipynb)。
图3
:单分子强度测量。
(
A
)对于位于橙色像素处的荧光团,其未校正的强度
Iuncorr
是通过对圆盘内所有像素的强度(黄色和橙色像素)进行求和来确定的,该圆盘(黄色和橙色像素)大到足以覆盖受信号影响的所有像素:
。
本地背景计算为磁盘周围环形(蓝色像素)中像素的平均值:
,其中
nring
是环中的像素数。荧光强度
I
是从未校正的强度中减去背景的结果,
I
=
Iuncorr
-
b
×
ndisk
,其中
ndisk
是磁盘中的像素数。圆半径通过追踪方法的
feat_radius
参数指定。环的宽度由
bg_frame
参数给出。如果一个信号的点扩散函数与另一个信号的背景环(底部面板)重叠,则受影响的像素(红色)将从本地背景分析中排除。如果两个点扩散函数重叠,则无法可靠地计算荧光强度,因此将被丢弃。(
二、三
)仿真表明,应用标准差为1像素的高斯模糊可将低荧光强度(
B
)下的信噪比提高到接近2的系数,并且几乎不会产生任何误差(略微低估小于1%,(
C
))
16
。此外,相对误差(即(
Imeas
-
Itruth
)
/
Itruth
,
其中
Itruth
是基本真理
,
Imeas
是分析的结果)
在整个强度范围内是恒定的,因此对于FRET效率和化学计量等比率量,可以抵消。所有地块均基于先前发表的作品
16
。缩写:SNR = 信噪比;FRET = Förster 共振能量转移。
请点击此处查看此图的放大版本。
7. FRET轨迹的可视化(可选)
8. 单分子数据分析与过滤(02.Analysis.ipynb)
9. 绘制结果并进一步分析(03.Plot.ipynb)
注意:有关 Jupyter 笔记本的屏幕截图和函数调用参数的说明,请参阅 补充信息 。
根据实验的科学问题,可以从smFRET轨道中提取各种低级和高级信息。这里,介绍了具有模拟和数字探针的分析管道示例:基于肽的分子力传感器 16 和具有随机开关其构象的DNA探针 38 。有关这些探头的设计和工作原理,请参见 图5 。
在按照协议中所述执行定位和跟踪算法后,该软件包提供了多个数据可视化工具来优化初始参数和后续的过滤步骤:(i)单个smFRET事件的可视化,(ii)可选的图像分割以分析某些感兴趣区域的数据,(iii)通过FRET效率与化学计量(E-S)图监测过滤器步骤。单分子数据的可视化如图 6 所示。
最后,滤波后的 FRET 事件由 E-S 图和 FRET 效率直方图表示( 图 4 )。E-S 图是优化上述滤波步骤和调查最终结果的有用工具。部分漂白或不完全标记的FRET传感器可以通过其化学计量值来排除。迁移率参数可以通过在 x-y 图( 图 6 )或均方位移 (MSD) 图( 图 4 )中绘制单个轨迹路径来研究。第一种方法对于区分移动和固定事件特别有用,而后者用于计算扩散系数。
图 4
:示例性输出。
(
A
)对于装饰玻璃支撑的脂质双层并由T细胞应变的分子力传感器(左图)的群体绘制了FRET效率与化学计量学(
E-S
图)。只有一个人口云可见。FRET效率的相应直方图说明了存在和不存在单元的力传感器群之间的差异(中间图)。在存在T细胞的情况下,可以观察到传感器群体的FRET效率降低的变化,这表明传感器模块几乎没有力依赖性拉伸。这些实验条件的MSD图证实,T细胞下方的力传感器群体比未结合的对应物移动得慢得多(右图)。(
B
)使用相同的分析是用Holliday连接DNA传感器装饰玻璃支撑的流体脂质双层进行的。
E-S
图清楚地显示了两个群体,这在FRET效率直方图中也很明显。
MSD 图指示存在一个快速移动的传感器群体。缩写:FRET = Förster 共振能量转移;MSD = 均方位移。
请点击此处查看此图的放大版本。
图5
:分子内FRET探针的设计和工作原理
(
A
)用于定量机械分子力的模拟肽传感器。供体和受体荧光团共价附着在肽主链的任一端。传感器模块特异性地附着在特定配体上,而配体又结合感兴趣的细胞驻留表面受体(此处为特异性识别T细胞受体β链的抗体片段)。在受体 - 配体结合时,施加力,传感器模块延伸并最终在键断裂后反冲。此面板从
16 修改而来
。(
B
) 用于定量 FRET 跃迁的数字 DNA 传感器。FRET传感器由形成Holliday连接的四条DNA链组成。供体和受体荧光团共价附着在两条链上。霍利迪结经常根据周围的缓冲条件切换其构象。这些构象的随机开关可以通过量化单个探头的FRET效率来监测。缩写: TCR = T细胞受体;FRET = Förster 共振能量转移。
请点击此处查看此图的放大版本。
图 6
:FRET 探头的定位和跟踪示例。
(
A
)通过量化供体激发时供体荧光团的强度(D→D),供体激发时受体荧光团的强度(D→A)和受体激发时受体荧光团的强度(A→A)来计算单个事件的FRET效率和化学计量。最近邻滤波通过闭合发射器的重叠点扩散函数防止偏差。图像分割允许用户选择定位在感兴趣区域(例如,细胞或微模式)内的某些smFRET事件。作为图像分割的一个例子,用Fura-2染色T细胞(显示在左侧)并进行自适应阈值以识别细胞边缘(橙色虚线)。比例尺 = 5 μm. (
B
) 使用分子力传感器的 smFRET 轨迹。可以在
x-y
平面中绘制单个轨迹,可视化其扩散行为和定位(左图)。此外,每个轨迹的强度可以随时间绘制,以识别FRET过渡或漂白步骤(中间面板从左侧面板显示红色轨迹)。由此产生的FRET效率和化学计量学可以类似地可视化(右图)。(
C
)使用Holliday连接DNA传感器的smFRET轨迹。在测量过程中使用HBSS +
12
mM MgCl2作为缓冲液。除了这些示例的序列末端附近的明显受体漂白步骤外,还可以确定每个传感器的FRET跃迁频率。Holliday结以高频率切换其构象,而分子力传感器不表现出FRET跃迁。这些信息使得调整实验条件(例如帧之间的延迟)以增加或减少观察到的转变次数成为可能。缩写:FRET = Förster 共振能量转移;smFRET = 单分子 FRET;HBSS = 汉克平衡盐溶液。
请点击此处查看此图的放大版本。
补充信息:单分子的定位和跟踪(01.Tracking.ipynb)。 请单击此处下载此文件。
本文详细介绍了对来自移动但表面系留探针分子的smFRET数据的自动记录和定量分析的管道。它补充了 smFRET 实验的两种主要方法,涉及表面固定探针或探针在溶液中扩散到共聚焦激发体积和从共聚焦激发体积 中扩散17 。它提供了正确的FRET效率和分子位置作为时间的函数。因此,它可以用作专用分析程序的输入,例如,量化过渡动力学 1 ,FRET直方图 39 或二维扩散 22 。
该软件根据开源促进会批准的免费开源许可证发布,该许可证授予用户免费使用,修改和再分发的永久权利。Github被选为开发和分发平台,以便通过报告错误或贡献代码 40 ,尽可能轻松地获取软件并参与开发过程。该软件是用Python编写的,不依赖于专有组件。选择Jupyter笔记本作为用户界面,便于在每个分析步骤中检查数据,并允许专门为手头的实验系统定制和扩展管道。 sdt-python 库 32 作为基础并实现了评估荧光显微镜数据的功能,例如单分子定位、扩散分析、荧光强度分析、色通道配准、共定位分析和 ROI 处理。
原则上,单粒子跟踪可以在一维、二维或三维系统中进行。在这里,单分子分析管道是为2D移动系统的研究量身定制的。这一选择反映了简单系统的可用性,例如平面支持的脂质双层(SLB),以呈现移动荧光探针。这种脂质双层体系通常由两个或多个磷脂部分组成,其中本体部分决定了SLB的关键物理化学参数(例如相和粘度),并且次要部分为生物分子提供了附着位点。这些附着位点可以是生物素化的磷脂,用于亲和素或链霉亲和素基蛋白质平台,或镍NTA偶联磷脂,用于具有组氨酸标签的蛋白质平台 41 。选择将蛋白质连接到SLB的适当平台取决于科学问题。读者可以参考文献 16 , 38 , 42 ,了解成功采用策略的示例。样品中探针的密度应足够低,以避免重叠点扩散函数;通常,建议每 μm2 少于0.1个分子。请参阅代表性结果部分(特别是 图6 ),了解显示合适探头密度的示例。该分析方法也适用于在活细胞质膜中扩散的单个荧光标记的蛋白质分子。
smFRET实验的一个关键方面是FRET探针本身的生产和表征。为FRET对选择荧光团时,其Förster半径应与预期的染间距离相匹配 43 。首选耐光漂白的染料,因为它们会产生长时间的痕迹。然而,对于升高的漂白率,可以使用一种荧光团物种通过逐步光漂白分析来识别来自共定位分子的多发射器事件;请参阅协议部分中的步骤 8.1.4。荧光团对应具有位点特异性并共价附着在感兴趣的分子上,形成分子内或分子间的FRET对。
将smFRET与其他现成的技术相结合可以将其空间分辨率提高到衍射极限之外(通过 STED44 )。这里介绍的smFRET跟踪算法拓宽了该方法对新实验设置和模型系统的适用性。这包括研究(i)移动生物分子化学计量的动力学变化,(ii)移动生物分子的动态关联,(iii)自由扩散反应物的酶促反应速率,以及(iv)移动生物分子构象变化的动力学。前两个示例需要显示分子间FRET的模型系统,即供体和受体与感兴趣的生物分子实体偶联。后一种例子可以利用在同一分子实体(分子内FRET)内携带供体和受体的生物传感器。
基于分子内FRET的传感器可以深入了解生物分子的内在构象变化 1 , 2 , 3 , 4 ,由内源性或外力负荷引起的构象变化(分子力传感器 16 ),或纳米环境中的离子浓度,如钙 45和pH46 .根据模型系统和首选的锚定平台,可以在2D或3D中跟踪此类smFRET事件:(i)smFRET事件的平面跟踪可用于量化质膜内受体 - 配体相互作用时间,膜锚定信号放大级联的关联以及表面受体的化学计量变化;(ii)smFRET事件的体积跟踪可用于活细胞或 体外 重组系统中的任何分子内或分子间FRET探针。
smFRET跟踪方法的开发主要考虑了分子内FRET探针。这些探针具有固定且众所周知数量的荧光标记,这一事实被用来拒绝来自团聚和错误合成(例如,不完全标记)分子的数据,以及来自其中一个荧光团已被光漂白的探针的数据。然而,通过调整滤波步骤,该方法也可以应用于分子间FRET探针。例如,与其只接受具有单个供体和单个受体荧光团的分子,不如检查供体和受体染料的空间轨迹,并选择例如共扩散供体 - 受体轨迹。
由于3D-DAOSTORM算法支持通过散光确定信号沿光轴的位置,这是由于发射光束路径中的圆柱透镜,因此3D实验可以轻松集成到分析管道中。在这种情况下,受体激发时的受体信号将用于确定化学计量和轴向位置。该分析软件还可用于利用其高度自动化和过滤方案来评估具有固定探头的实验数据。事实上,使用该软件的早期版本分析了固定在凝胶相双分子层 38 上的Holliday结的smFRET效率数据集。
作者声明没有利益冲突。
这项工作得到了奥地利科学基金(FWF)项目P30214-N36,P32307-B和维也纳科学技术基金(WWTF)LS13-030的支持。
Schrangl, L., Göhring, J., Kellner, F., Huppa, J. B., Schütz, G. J. Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes. J. Vis. Exp. (177), e63124, doi:10.3791/63124 (2021). … More
Schrangl, L., Göhring, J., Kellner, F., Huppa, J. B., Schütz, G. J. Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes. J. Vis. Exp. (177), e63124, doi:10.3791/63124 (2021).
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