基于转录组学膀胱癌临床预后模型的构建

Construction of prognosis model of bladder cancer based on transcriptome

Qiu CHEN , Liangliang CAI , and Jingyan LIANG

Qiu CHEN

1.扬州大学医学院，江苏扬州 225001

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Liangliang CAI

1.扬州大学医学院，江苏扬州 225001 2.扬州大学转化医学研究院，江苏扬州 225001 3.江苏省中西医结合老年病防治重点实验室，江苏扬州 225001

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Jingyan LIANG

1.扬州大学医学院，江苏扬州 225001 2.扬州大学转化医学研究院，江苏扬州 225001 3.江苏省中西医结合老年病防治重点实验室，江苏扬州 225001 1.扬州大学医学院，江苏扬州 225001 2.扬州大学转化医学研究院，江苏扬州 225001 3.江苏省中西医结合老年病防治重点实验室，江苏扬州 225001 ADCY9 、 MAFG_DT 、 EMP1 、 CAST 、 PCOLCE2 、 LTBP1 、 CSPG4 、 NXPH4 、 SLC1A6 ，以此建立膀胱癌患者预后预测模型。训练集中高风险组和低风险组3年存活率分别为31.814%和59.821%，测试集中高风险组和低风险组3年存活率分别为32.745%和68.932%，模型预测训练集和测试集患者预后的ROC曲线下面积均在0.7以上。

结论：

本研究建立的模型对膀胱癌高风险和低风险人群的生存情况具有较好的预测能力。

Abstract

Objective

: To screen for prognosis related genes in bladder cancer, and to establish prognosis model of bladder cancer.

Methods

: The clinical information and bladder tissue RNA sequencing data of 406 bladder cancer patients, and the bladder tissue RNA sequencing data of 28 healthy individuals were downloaded from The Cancer Genome Atlas (TCGA) database, Genotype-Tissue Expression (GTEx) database through the UCSC Xena platform. The weighted gene co-expression network analysis (WGCNA), univariate Cox regression, LASSO regression analysis and multivariate Cox regression analysis were used to screen the prognosis-related genes of bladder cancer and the prognostic model was established. The prognostic model was evaluated with receiver operator characteristic curve (ROC curve).

Results

: A total of 2308 differentially expressed genes related to bladder cancer were obtained from the analysis. Six gene modules were obtained by WGCNA, and 829 genes with significant effect on bladder cancer prognosis were screened out. Univariate Cox regression and LASSO regression analysis showed that 24 genes were related to the prognosis of bladder cancer patients. Multivariate Cox regression analysis revealed 9 genes as independent predictors in training set, namely ADCY9 , MAFG_DT , EMP1 , CAST , PCOLCE2 , LTBP1 , CSPG4 , NXPH4 , SLC1A6 , which were used to establish the prognosis model of bladder cancer patients. The 3-year survival rates of the high-risk group and the low-risk group in the training set were 31.814% and 59.821%, respectively. The 3-year survival rates of the high-risk group and the low-risk group in the test set were 32.745% and 68.932%, respectively. The areas under the ROC curve of the model for predicting the prognosis of bladder cancer patients in both the training set and the test set were above 0.7.

Conclusion

: The established model in this study has good predictive ability for the survival of bladder cancer patients.

Keywords: Urinary bladder neoplasms, Prognostic, Transcriptomics, The Cancer Genome Atlas database, Genotype-Tissue Expression database, Weighted gene co-expression network analysis, Regression analysis

基因型和基因表达量关联（Genotype-Tissue Expression，GTEx）;癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）;差异倍数（fold change，FC）;加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）;危险比（hazard ratio，HR）;受试者操作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC曲线）;曲线下面积（area under the curve，AUC）;

膀胱癌是常见的恶性肿瘤，发病率和病死率均居泌尿系统肿瘤的第一位。膀胱癌是一种分类复杂的肿瘤，在组织学层面可分为非肌层浸润性膀胱癌（约75%）和肌层浸润或转移性膀胱癌（约25%），复杂的癌症种类增加了临床诊治难度。非肌层浸润性膀胱癌患者5年总存活率达90%，但肌层浸润性膀胱癌患者5年存活率约为36%，转移性膀胱癌患者5年存活率仅为5% 。在欧洲，膀胱癌患者的5年标准相对存活率差异较大；而在大多数发展中国家，基于大范围人群的膀胱癌患者生存情况统计数据较为缺乏，因此找到新的生物标志物和建立较为完善的预后模型对膀胱癌患者的临床诊断和治疗显得尤为必要。

风险分层是一种有效的癌症管理工具，合理的风险分层不仅可以增加对高风险人群的正确干预，还减少了对低风险人群的不必要干预。相较于传统的肿瘤临床参数，基于基因分子风险分层能够更好地评估肿瘤原位免疫细胞浸润、异常DNA水平和信使RNA水平，以便对人群进行更加精准的预后管理。

高通量测序是一种测量分子对肿瘤影响程度的有效手段。RNA测序是高通量测序探索转录组学信息的主要工具，已广泛应用于肿瘤研究领域。RNA测序可以获得特定组织或器官几乎所有转录组的测序信息，且可以更精准获取剪接基因、融合基因、等位基因等在特殊部位的表达情况，为发现癌症中心基因与建立癌症预后模型提供了便利。本研究筛选多个高通量RNA测序数据，寻找正常膀胱组织和膀胱癌组织差异表达的基因，并确定与患者总体生存状态显著相关的基因，建立预后风险分层评分模型并验证模型预测的准确性。

通过UCSC Xena平台（ http://xena.ucsc.edu/ ）下载GTEx、TCGA数据库中406例膀胱癌患者的临床信息和膀胱癌组织RNA测序数据，以及28名健康对照者的正常膀胱组织RNA测序数据。

从GTEx、TCGA下载的数据集均为“FPKM”格式，将其统一转换为log ₂ （x+1）形式，然后调用R包“limma”，以|log ₂ FC|>1和 P <0.05为临界值筛选正常膀胱组织和膀胱癌组织差异表达基因（log ₂ FC>0表明基因在肿瘤组织中过表达）。

调用R包“WGCNA”进行基因模块聚类，评估各模块与临床表征的相关性。具体步骤如下：①从TCGA中提取膀胱癌患者的年龄、性别、组织学分级、临床分期、TNM分期、总体生存时间、总体生存状态等临床资料；②对提取的临床资料和筛选出来的差异表达基因进行聚类以检测异常值；③选取最佳无标度拓扑模型拟合指数的软阈值，达到无标度拟合数大于0.9的较高网络平均联通性；④将邻接矩阵转变为拓扑重叠矩阵，定义基因共表达相似性；⑤基于拓扑重叠矩阵测度的相异性，调用“hclust”算法进行基因层次聚类；⑥设置最佳模块大小为30，并使用动态树切割识别模块；⑦计算模块特征基因的相似度后，将相似度临界值设置为0.75，合并相似度较高的模块；⑧关联模块内基因与临床表征数据。以 P <0.05为标准，对聚类结果中的模块基因进行筛选。

将1.3筛选后的基因投入R包“survival”进行单因素Cox回归分析，以 HR >1和 P <0.005为标准进行筛选。再将筛选后的基因用R包“glmnet”通过LASSO回归分析进一步缩小范围，选择最佳调谐参数（λ）以实现交叉验证图中的最小部分似然偏差。仍不为0的对应系数的基因输入多因素Cox回归模型。调用R包“caret”将TCGA中的膀胱癌标本随机分为训练集和测试集（每个集合203个标本），在训练集中建立模型：将最终筛选出基因的表达量乘以其Cox回归系数，并将这些值相加，计算出风险评分。

根据预后模型计算出每例患者的风险评分；基于训练集、测试集患者风险评分的中位数，将两个集合中的患者分成高风险组和低风险组；调用R包“survival”绘制Kaplan-Meier生存曲线，计算各组的3年存活率；调用R包“survivalROC”绘制训练集和测试集中风险评分预测患者1年和3年生存的ROC曲线，计算AUC。

通过分析406例膀胱癌患者的膀胱癌组织数据和28名健康对照者的正常膀胱组织数据，筛选出差异表达基因2308个。其中，膀胱癌组织相比正常膀胱组织上调的基因有558个，下调的基因有1750个。

提取TCGA数据库中406例膀胱癌患者的基因图谱和临床表征数据，绘制标本树状图和临床表征热图（图1 A），确定软阈值为5（图1 B）。基于拓扑重叠矩阵基因聚类，模块大小为30的动态树形切割共产生9个颜色编码模块。通过计算模块特征基因的相似度，将相似度较高的模块进行合并，最终确定6个模块（图1 C），总体生存状态与6个模块均具有一定相关性（图2 ）。以 P <0.05筛选出对膀胱癌发展预测有显著作用的基因829个。

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加权基因共表达网络分析结果A：标本树状图和临床表征热图，二分类变量（总体生存状态、性别）以红色或白色块表示，多分类变量（年龄、组织学分级、临床分期、原发肿瘤、区域转移、远处转移、总体生存时间）以颜色编码块表示，颜色饱和度与变量值对应. B：确定最佳无标度拓扑模型拟合指数（左）和平均连通度（右）的软阈值，红色的水平线表示=0.9. C：基于拓扑重叠矩阵的基因聚类，具有相对相关性的基因位于同一或相邻的分支上.

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单因素Cox回归分析结果显示，132个基因与膀胱癌患者预后相关性较强。在基于LASSO惩罚的 Cox回归中，随着log λ改变，确定基因的对应系数也降为0（图3 A）。在交叉验证中，24个基因达到部分拟然偏差的最小值且24个基因显现出一定的效应作用， HR 均大于1，提示其对膀胱癌的发生发展有积极作用（图3 B）。多因素Cox回归分析训练集数据得到9个作为独立预测因子的基因，分别是 ADCY9 、 MAFG_DT 、 EMP1 、 CAST 、 PCOLCE2 、 LTBP1 、 CSPG4 、 NXPH4 、 SLC1A6 （图3 C）。预测风险得分=–0.659× ADCY9 +0.372× MAFG_DT + 0.286× EMP1 +0.346× CAST +0.379× PCOLCE2 + 0.234× LTBP1 +0.219× CSPG4 +0.176× NXPH4 + 0.210× SLC1A6 。

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LASSO回归模型及多因素回归分析结果A：132个与膀胱癌预后相关差异表达基因的LASSO系数分布，每条曲线代表一个系数，当调谐参数（λ）变化时，非零系数随之变化，进入LASSO回归模型；B：选择最佳λ的交叉验证，红色虚线与最佳对数λ交叉时，相当于多元Cox模型的最小值，两条虚线表示距离最小值一个标准差；C：基于训练集的多变量Cox回归分析结果.

计算训练集的风险得分，根据中位数（0.944）将训练集分为高风险组和低风险组，高风险组和低风险组3年存活率分别为31.814%和59.821%；ROC曲线分析结果显示，模型预测患者1年和3年生存的AUC分别为0.736和0.722（图4 ）。采用相同的方法对测试集进行预后模型准确性检验，以中位数（1.002）将测试集分为高风险组和低风险组，高风险组和低风险组的3年存活率分别为32.745%和68.932%；ROC曲线分析结果显示，模型预测患者1年和3年生存的AUC分别为0.784和0.726（图4 ）。上述结果提示，建立的模型对膀胱癌高风险和低风险人群的生存情况具有较好的预测能力。

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膀胱癌患者预后预测模型验证结果A、D：训练集和测试集中患者的风险评分，垂直虚线左侧点代表低风险患者，右侧点代表高风险患者，水平虚线为低风险患者和高风险患者风险得分临界值；B、E：训练集和测试集中患者的Kaplan-Meier生存曲线图；C、F：训练集和测试集中风险得分预测患者1年和3年生存的ROC曲线.

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，可发生于任何年龄。为了提高膀胱癌的临床预后，寻找潜在的生物标志物建立预后模型成为目前亟待完成的任务。本研究基于TCGA数据库RNA测序数据开发出膀胱癌预后模型，经验证发现，该模型对膀胱癌患者的预后具有良好的评估能力。

本研究在筛选用于建立膀胱癌预后模型的基因时联合使用了WGCNA分析、单因素Cox回归分析、LASSO回归分析、多因素Cox回归分析这四种生物信息学工具。WGCNA是一种强大的生物信息学工具，可检测与临床功能相关基因簇，识别临床相关基因标志物，将具有相似临床功能的基因划分在同一模块中。本文资料中，WGCNA分析与普通的聚类方法不同点为WGCNA将膀胱癌基因表达值的相关系数取N次幂，使相关系数分布更符合无标度网络分析，从而更符合生物学规则。LASSO回归分析可以在众多癌症相关变量中筛选出与患者预后最相关的核心变量，在不降低临床预测能力的前提下优化模型，减少无关变量对预测水平的干扰。本方法与普通共表达网络分析不同的是加入软阈值和权重网络的概念，形成加权的共表达网络。在单因素Cox回归分析的基础上，本研究利用多因素Cox回归分析对基因做进一步筛选，提高了预后预测模型的预测效能。本研究在评价建立的膀胱癌预后模型时，运用了风险分层的方法预测患者的存活率。相比Kang等直接对所有患者进行生存预测的方法评价预后模型，本研究通过风险分层对高风险与低风险人群的差异化生存评价展现了模型对不同人群生存状态的精准预测能力。

本研究最终筛选得到9个与膀胱癌患者预后相关的基因： ADCY9 、 MAFG_DT 、 EMP1 、 CAST 、 PCOLCE2 、 LTBP1 、 CSPG4 、 NXPH4 、 SLC1A6 。其中大部分基因在各类癌症的迁移和侵袭中均具有调控作用。ADCY9是一种调节信号转导的酶，Yi等通过在组织微阵列上进行ADCY9抗体免疫组织化学染色，发现高表达的ADCY9参与了结肠癌的迁移和侵袭，是结肠癌患者无病生存期的不良预后因素。 MAFG_DT 是一种RNA基因，为长链非编码RNA。Xiao等 MAFG 基因通过直接结合和稳定人类抗原R上调多聚嘧啶区结合蛋白1来促进膀胱尿路上皮癌的增殖、侵袭、转移。 EMP1 是一种蛋白编码基因，也属于长链非编码RNA。Peter等通过提取膀胱癌尿路上皮细胞的长链非编码RNA并进行表达量测定，揭示 EMP1 是肿瘤抑制因子和细胞增殖的负调节剂。 PCOLCE2 和 LTBP1 分别抑制卵巢癌、乳腺癌的浸润与扩散 CSPG4 、 NXPH4 、 SLC1A6 也参与肿瘤的进程并发挥重要作用。在肿瘤相关的临床试验和体外实验中，暂未发现关于 CAST 基因的讨论。

本研究通过一系列生物信息学分析，筛选到的基因更为精准，因此模型预测效能也更高。石海林等筛选得到23个膀胱癌相关基因，预测患者总体生存情况的AUC为0.743，但其研究结果未经测试集验证；米琦等基于2个基因建立膀胱癌患者预后模型，预测患者3年生存情况的AUC为0.656，其模型也未经测试集验证；Chen等建立了基于8个基因的膀胱癌患者预后模型，预测训练集患者总体生存情况的AUC为0.795，但该模型预测测试集患者总体生存情况的AUC为0.669；Chen等建立了基于2个基因的膀胱癌患者预后模型，预测训练集患者1年和3年生存情况的AUC分别为0.665和0.635，预测测试集患者1年和3年AUC分别为0.758和0.711。本研究建立的模型预测训练集和测试集患者1年和3年生存情况的AUC均在0.7以上，总体上高于以往研究中建立的模型。

综上所述，本研究较为系统地构建了一个膀胱癌预后模型，该模型对膀胱癌患者的预后有一定的预测作用，可用于临床长期大样本的病例试验并进一步验证。

Funding Statement

国家重点研发计划（2016YFE0126000）；江苏省自然科学基金（BK20200935）；江苏省高等学校大学生创新创业训练计划（202011117002Z）

COMPETING INTERESTS

所有作者均声明不存在利益冲突

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