OCT 是一种诊断工具, 有助于检查视网膜结构 ¹ , 包括视神经头 (ONH)。多年来, 它已经成为人类疾病进展的可靠指标 ^{2 , 3} , 以及啮齿动物 ^{4 , 5} 。它使用干涉法来创建2µm 轴向分辨率的视网膜层的横断面图像。最内层是视网膜神经纤维层 (纤维), 含有研资局轴突, 其次是神经节细胞层 (协鑫), 其中大部分为研资机构。其次是内部状层 (彩光), 在那里, 王国的树突满足两极, 水平, 和突细胞轴突。这些, 连同水平的细胞, 形成内部核层 (INL), 并且他们的突起连接与感光轴突在外部状层 (组织)。其次是外核层 (只), 与感光细胞体, 并通过外部限制膜 (OLM) 与感光层分离, 也称为内段/外段 (是/OS) 层。最后, 在小鼠视网膜的最后可见层是视网膜色素上皮 (RPE) 和脉络膜 (C)。单独的纤维通常太薄, 不能用老鼠来测量;因此, 分析纤维/协鑫是最好的 ^{4 , 5} 。另一个可能性是 GC 复合层, 它包含了后者, 除了光子, 使它更厚, 从而更容易测量 OCT 扫描 ⁴ 。因此, OCT 可以提供洞察的病理状态的视网膜, 如在 OPNs。

另一种方法是, 用 剖检 组织学来分析小鼠视网膜的厚度。然而, 这项技术面临的限制与组织收集, 固定, 切割, 染色, 安装, 等 因此, 一些缺陷, 如微妙的厚度变化, 无法检测到。最后, 由于同一鼠标不能在多个时间点测试, 所以每项研究的动物数量大大增加, 不像 OCT。所有的侵入、高分辨率、重复的可能性、时间的监控以及 OCT 技术的易用性使其成为视网膜疾病研究的首选方法。

小鼠模型用于识别基因缺陷并阐明 retinopathies ⁶ 的分子机制。OPN 是一种视网膜病变, 对视神经 (ON) 有很大的损害, 由大约120万王国的神经轴突构成。OPN 可以集中在上, 也可以是次要的其他疾病, 先天或不 ⁷ , 导致视觉领域的损失, 后来, 失明。OPN 的特征性状为研资损失和损害, 可在人类 OCT 中观察到为纤维和协变细化 ^{2 , 3} 。同时, OPN 的病理生理学尚不清楚, 因此需要对小鼠视网膜进行检测。

这份手稿描述了视网膜层厚度的成像和量化, 使用 Opa1 ^delTTAG 鼠标线 ^{8 , 9} 的例子, 一个显性光学萎缩 (DOA) ¹⁰ 的模型。评估研资局的病理生理学、放射、矩形和环形扫描的数量。这是通过 OCT 软件提供的标准卡尺或为开源图像处理程序开发的自制宏完成的。标准卡尺是难以操作, 往往比纤维/协进会厚, 而自制卡钳是易于使用, 重现性, 更精确。该宏在 peripapillary 区域的 ONH 的两侧对自动检测到的层进行了测量, 在5点和固定位置上。所提出的协议的目的是描述 OCT 扫描获得指定视网膜定位, 重点是视网膜。

《实验议定书》获得了国家 #233 和 #233;d icale (Inserm; 研究);蒙彼利埃, 法国), 符合欧洲的指示, 并符合帕特声明的使用动物在眼科研究。它是根据《动物实验 (CEEALR; nuCEEA-LR-12123) 》中的《伦理道德的一致性的协议进行的.

1. 设备设置和预成像准备

注意: 在这里, OCT 是利用光谱域 (SD) 眼科成像系统 ( 图 1A ) 在小鼠视网膜上进行的。SD OCT 设备包括一个基地和动物成像坐骑 (AIM) 与啮齿动物对齐阶段 (RAS) ( 图 1B )。该底座包括计算机、oct 引擎、SD oct 探头和鼠标专用镜头。探头安装在目标上, 其中包括 Z 转换器。该 RAS 用于鼠标定位感谢表与 X 和 Y 翻译, 磁带可以旋转和旋转, 以及可移动的叮咬酒吧与鼻带。制造商提供的软件允许对 OCT 文件进行获取和分析, 尽管后者也可以通过开源图像处理程序完成.

1. 将探测器牢牢地放置在目标中.
2. 将鼠标特定的镜头连接到探测器.
3. 调整特定镜头的参考臂设置 (此处为 086, 位置为 964).
4. 确保鼠标特定的镜头离卡带足够远, 将咬杆与鼻带连接到卡带上.
   注: 镜头与卡带之间的距离可与 Z 型转换器螺钉一起调整, 位于目标背面。鼻带是一个商业上可用的弹性带, 其张力应根据鼠标大小调整.
5. 打开 "电源 (购物车右下角)" 和 "计算机".
6. 若要启动图像处理程序, 请双击屏幕上相应的快捷方式.
   注: 这取决于透镜的类型;这里, 老鼠视网膜.
7. 创建新的临床研究并添加所需的协议。否则, 使用现有的临床研究和/或协议.
   1. 通过选择和 #34 添加新的研究; 研究名称和 #34;; #34; ID 和 #34;; #34; 处理臂规格和 #34; (这里, #34; 未和 #34;); 预定义和 #34; 扫描协议和 #34; 如果它们存在.
8. 选择 #34; 考官和 #34; 在和 #34; 临床研究和 #34; 部分.
   注意: 对于一个新的 #34; 考官和 #34;, 去和 #34; 设置考官和 #38; 医生和 #34; 定义它.
9. 通过单击添加患者, 在患者/考试部分添加新病人; 进入 #34; 身份证和 #34;, #34; 姓名和 #34;、#34; 姓氏和 #34;; #34; 性与 #34; #34;d 吃了生与 #34; (可选).
   注意: 在测试每只鼠标之前, 如果更方便的话。请确保该 ID 不长于10字符。对于鼠标, 两个眼睛的折射误差为 0, 轴向长度为 23.0.
10. 单击和 #34; 添加考试和 #34; 选择所需的和 #34;P rotocol 和 #34; 通过添加和 #34;P 重置扫描和 #34; 从列表中, 从将首先测量的眼睛开始 (这里, 右眼), 或通过自定义扫描.
11. 若要自定义扫描, 请使用现有的扫描作为模板并对其进行编辑, 或从头开始通过和 #34 创建它; 添加自定义扫描和 #34; 选项。将所有扫描添加到列表后, 使用 "#34" 定义新协议; 输入和 #34; 新协议名称和 #34; 选项 (OS:26 险恶, 左眼;26: 德克斯特, 右眼).
    注意: 在这里, 协议涉及三扫描: (i) 径向扫描, 具有1.4 毫米直径, 0 毫米水平和垂直偏移, 1000 行 a 扫描/b 扫描, 100 b 扫描/卷, 1 帧/b 扫描, 80 行非活动 a 扫描/b 扫描, 和1卷;(二) 矩形扫描, 长度和宽度为1.4 毫米, 0 和 #176; 角度, 0 毫米水平和垂直偏移, 1000 行 a 扫描/b 扫描, 100 B 扫描, 1 帧/b 扫描, 80 行非活动 a 扫描/b 扫描, 和1卷;和 (iii) 环形扫描, 最大直径为0.4 毫米和0.6 毫米, 0 毫米水平和垂直偏移, 1000 行扫描/b 扫描, 3 b 扫描/卷, 48 帧/b 扫描, 80 行非活动 a 扫描/b 扫描, 和1卷.

2。鼠标准备

1. 眼球扩张和固定
   在数据采集前至少15分钟, 将10% 肾上腺素滴眼液注入老鼠眼中, 除去多余的, 并注入0.5% 卡滴眼液.
   1. 注: 第一次扩张可以做一次对所有的老鼠, 将在会议上进行测试。确保液体在室温下.
   2. 在诱导全麻 (步骤 2.2) 后, 立即管理0.4% 盐酸因滴眼液, 使其保持在3秒的位置以麻醉和固定眼睛。然后, 擦掉掉滴, 再重复10% 肾上腺素和0.5% 卡的灌注, 以确定眼睛是否有很好的扩张.
      注意: 确保液体在室温下, 并且老鼠不会吞下因.
2. 全麻
   1. 在盐水中制备氯胺酮 (20 毫克/毫升) 和嗪 (1.17 毫克/毫升) 的麻醉液。存储在4和 #176; C 最多2周.
   2. 大约5分钟前测试, 腹腔注射 5-10 和 #181; L 的麻醉液每1克的身体质量, 取决于年龄和大小的鼠标.
      注意: 幼鼠和/或瘦老鼠需要较少的麻醉剂, 少花点时间麻醉, 但也能更快地苏醒。这里, 8 和 #181; 升/克 (160 毫克/千克氯胺酮, 9.33 毫克/千克的嗪).
   3. (可选) 用粘稠滴眼药水或眼部凝胶润滑眼睛, 以避免角膜干燥.

3。鼠标定位

1. 用粘性 glycol-based 眼药水润滑眼睛以提供角膜水化.
   注意: 如果在考试中眼睛看起来很干燥, 请重新申请眼药水.
2. 将鼠标包裹在一张外科纱布上以保持体温.
3. 使用海绵或棉芯, 在每只眼睛上应用一层薄薄的眼部凝胶0.3% 甲, 以减少光的折射, 避免混浊, 并确保角膜水化。这样做的时候, 把睫毛和胡须移到一边.
4. 将鼠标置于盒式磁带中, 并将其头部伸直并向前指向.
5. 轻轻打开咬杆钳, 将杆放在嘴里; 用鼻带固定位置.
   注意: 确保咬杆位于卡带的中间.
6. 如果右 (左) 眼正在测试, 请在右侧 (左) 侧放置一个棉卷.
7. 同时在鼠标特定的镜头上保持夹紧的瞄准头, 通过逆时针旋转 Z 转换器螺钉将其对准眼睛.
8. 通过转动和旋转卡带, 并通过转动咬杆和 X 转换器螺钉, 预先设定鼠标的位置; 目标是让右眼直视镜头, 从而使眼睛和镜片的光轴对准.
   注意: 如果鼠标太高或过低, 应首先使用 Y 型转换器螺钉.
9. 选择 #34 中的第一个扫描; 考试和 #34; 单击 #34; 开始瞄准和 #34; 并对视网膜成像进行进一步的人工调整.
   1. 使用 Z 转换器螺钉, 在左侧面板上垂直移动视网膜 ( 图 2 , 水平 B 扫描对齐), 并水平在 r 上可选面板 ( 图 2 , 垂直 B 扫描对齐).
   2. 旋转盒式磁带, 通过将 ONH 向上或向下移动, 使 ONH 位于右侧面板的中间。使用咬杆螺钉在右侧面板上伸直视网膜。旋转卡带, 将 ONH 放置在左侧面板的中间.
   3. 使用 X 转换器螺钉在左侧面板上水平视网膜。记住每个调制器的主要功能, 进一步调整视网膜的位置以集中 ONH.
      注: 如有必要, 使用 Y 型转换器螺钉在右侧面板上上下移动 ONH。该位置可以在扫描之间的任何时间被细化.

4。ONH 和视网膜的 SD oct 成像

1. 一旦内容具有调整, 请单击 #34; 启动快照和 #34; 开始 sd oct 扫描.
   1. 如果不需要3D 成像, 请取消选中 OCU 选项.
2. 保存扫描和报表.
3. 继续进行下一次扫描.
4. 图像的第二眼, 在缩回镜头后, 相应地打开卡带, 重复步骤 3.6-4.3.

5。购置完成

1. 当采集完成时, 将鼠标从卡带上取出, 用0.3% 甲的眼部凝胶涂抹在每只眼睛上, 并将鼠标放在加热板上唤醒.
2. 上次购置后, 关闭软件并关闭计算机和 OCT 计算机 (电源按钮).
3. 用消毒剂清洗卡带.

6。分析

1. 用于视网膜层厚度测量, 请使用制造商提供的自动分割软件.
   1. 单击 和 #34;P atient 和 #34; , 选择所需的 和 #34; 考试和 #34; 然后单击 和 #34; 查看考试和 #34; 选项.
   2. 通过右键单击所需扫描的文件夹图标, 将所需的 oct 数据加载到 oct 软件中.
   3. 右键单击 B 扫描; 通过启用10测量卡尺来配置卡尺; 并输入它们的名称、角度和颜色.
   4. 通过右键单击 B 扫描来选择所需的卡尺; 将其相应放置到视网膜上进行测量.
      注意: 对于以 ONH 为中心的扫描, 在它的每一侧设置5卡尺, 彼此等距。对于 peripapillary 分析, 请确保卡尺没有放置太远的 ONH。对于径向扫描, 分析 OCT 软件选择的每扫描10图片。在 和 #34; 报告和 #34; 文件夹中可以找到它们的编号.
   5. 通过右键单击 B 扫描并单击 并 #34 将结果保存在电子表格软件程序中进行分析; 保存结果和 #34;
      注意: 结果可以在与扫描数据相同的文件夹中找到.
2. 也可以使用自制的卡尺宏, #34; MRI 视网膜工具和 #34, 为开源图像处理程序开发 (参见材料表).
   1. 确保 #34; MRI 视网膜工具和 #34; 和 #34; 修改多边形剖面工具和 #34; 宏处于活动状态。加载图像。单击 m 按钮开始测量.
      注意: 宏自动在 ONH 的两侧创建一个0.2 毫米长的测量盒。每个卡带包含5测量点, 功能作为卡尺。它们的横向位置是不可更改的, 并为径向扫描中的 peripapilla 定制。盒式磁带的水平位置是预先定义的, 用来测量纤维/协变厚度, 但可以很容易地修改以测量 GC 复杂层。如果扫描质量较差, 则需要调整水平位置, 或者需要从分析中排除图片.
   2. 对于水平调整, 单击 "e" 按钮。在新开的 #34; ROI 管理器和 #34; 窗口中, 选择第一个卡带.
   3. 单击蓝色多边形按钮, 然后通过单击图片中测量图层的边框来调整第一个卡带的位置.
   4. 对第二个卡带进行重复, 首先在 #34 中选择它; ROI 管理器和 #34; 窗口, 然后单击相应的图像。点击 r 按钮测量。查看 #34 中的结果; 测量和 #34; 窗口.
      注意: 结果可以随时复制到电子表格软件程序中。它们包含了正确的卡带 (r), 左卡式 (l) 和总计: Intden-综合密度在卡带内的以下值;面积: 测量面积, 以 mm ² ;长度的卡尺内的卡带, 在毫米;平均值: 在卡带内的平均信号强度;和 Std: 信号平均强度的标准误差.
   5. 继续执行下一图像.
   6. 进一步分析电子表格软件程序中的数据.
      注意: 要查找层的平均厚度, 请取十 Len 值.

SD OCT 技术使视网膜的想象和厚度分析可以与组织学相媲美, 但速度更快且更详细 ( 图 3 )。正如野生 C57Bl/6 小鼠所提出的, 即使 SD OCT 扫描 ( 图 3A , 右) 的质量不如视网膜横断面 ( 图 3A , 左) 的图像好, 它可视化更多的层 ( 例如, OLM)。此外, 它只需要大约40分钟, 包括小鼠准备, 与几天或几周的组织学分析。最后, 它不需要加工和染色, 如苏木, 红红, 和藏红花, 这可能损害组织和导致收集错误的数据。在 OCT 很容易测量的视网膜层包括纤维/协鑫, 彩光, INL, 组织, 仅, 是/OS, RPE, 和 C ( 图 3B ), 因此允许对整个视网膜进行复杂的研究。因此, 视网膜结构的变化反映了疾病的发展。在 OPNs 的情况下, 这适用于视网膜和上, 从而纤维/协鑫和光子。

DOA 是最常见的 OPNs 之一, 其特点是纤维的退化和损失的 ¹¹ 。由于突变的 OPA1 基因 ¹² , 它导致视力损害和失明。使用 Opa1 ^delTTAG 鼠标模型, 它携带人类复发的 c. 2708 delTTAG 突变, 它被发现 Opa1 haplo-不足阻碍视觉在性别依赖性的方式 ^{8 , 9} 。这是根据 OCT 测量视网膜厚度的基础上确定的, 它显示了 GC 复合层 ( 图 4A ) 和 peripapillary 纤维 ( 图 4B , 4C ) 在 Opa1 ^+/- 雌性中的渐进增厚。在这些实验中, 用标准卡尺进行矩形扫描, 并进行环形扫描的开源图像处理程序进行计算。对于径向扫描, 这往往是一个较低的质量, 并产生一个最小的10图像每视网膜分析, 一个自制的宏观发展。标准和自制卡尺 ( 图 4D ) 的比较表明, 纤维/协鑫和 GC 复合层的厚度明显低于后者。这是因为标准卡尺是更厚, 更难以放置在边界的层。因此, 最好避免使用标准卡尺的薄层, 特别是在径向扫描。

总而言之, SD OCT 允许鼠标视觉分, 可以重复多个时间点。然而, OCT 扫描的类型和测量方法必须适应所调查的疾病, 因此视网膜层的问题。然而, OCT 提供了足够的信息来识别视网膜结构的缺陷。但是, 必须用另一种方法进一步分析这一点, 以提供对底层机制的全面理解。

OCT 系统是一种非侵入 性的活体 成像方法, 它提供了高分辨率的视网膜横断面扫描。因此, 它的主要优势是它的详细分析的潜力, 与极好的机会, 转置协议常规适用于人类的鼠标模型。

在 Opa1 ^delTTAG 突变小鼠的例子中, SD OCT 结果显示了纤维和 GC 复合层厚度的增加, 这使得对 DOA 病理生理学的进一步探索 ⁹ 。这是不可能完全通过组织学分析。相比之下, 组织学不提供可视化整个视网膜的可能性, 不像环形或径向 OCT 扫描。此外, 考虑到有几个时间点的动物数量增加, 它更费时而且费用更高。事实上, SD OCT 铺平了道路, 在 DOA, m ü ller 细胞 ⁹ 的新的视网膜细胞类型的牵连。这做了尽管事实没有单细胞决议和具体细胞证明是可能的与系统。相反, 以厚度为重点和/或一般的国家重点分析的 peripapillary 地区, 足以检测细胞恶化。然后再进行组织学调查, 可以清楚地知道要找什么。因此, 同样的方法也可以用于评价治疗干预, 以防止或刹车视网膜变性。

为了进一步提高 OCT 的实用性, 国产卡尺的研制和精度要比标准的高得多。尽管标准比纤维/协鑫的更厚, 但有些团队仍然使用它, 但对于更大的层 ¹³ 。在这里, 我们集中了对视网膜的比较分析在10射线扫瞄每视网膜, 所有在 peripapillary 区域。纤维单独不是可测量的在射线扫瞄任一方式。这层是太薄和含糊;因此, 对纤维/协鑫和 GC 复合层进行了测量。同时, 我们成功地测量了纤维使用环形扫描, 这证明有利于小鼠分。然而, 可靠性可能是有争议的。在所有这些方法中, 关键的一步是将扫描集中在 ONH 上, 并在没有阴影和混浊的情况下对视网膜进行可视化。前者可以很容易地按照该协议的步骤来调整视网膜的位置。后者取决于角膜和晶体的透光率。例如, 如果眼胶的分布不均匀, 扫描是模糊的,/或视网膜出现弯曲。为了解决这个问题, 这将是足够的正确重新申请凝胶。如果晶体是不透明的, 则扫描是暗的或不完整的。这里的解决方案是, 如果透明的晶体返回, 将再次扫描一天。另一个可能的原因是质量差的扫描是存在的障碍, 如胡须或睫毛。这些可以很容易地删除, 搁置和应用一小眼凝胶, 以保持它们到位。其他的分析方法, 不同的设备类型, 扫描类型, 角度, 和其他参数也存在, 并有不同数量的分析图像。如果结果质量仍然不理想, 必须考虑这一点。例如, Liu et al. 在多个角度进行了径向扫描 ¹³ , 相比之下, 我们的径向扫描仅有一个, 报告的层数略厚。然而, 本文所提出的 OCT 采集和分析方法适合于 peripapillary 小鼠视网膜视网膜的分析。

总之, OCT 是一项潜力巨大的技术。它能够检测视网膜结构的细微变化--包括视网膜, 特别是在 OPNs--并证明对视觉科学是不可缺少的。因此, 所提出的协议是实用的 OPN 小鼠模型分, 以及评价的新疗法。