https://doi.org/10.1002/imt2.64

REVIEW ARTICLE

● 2022年11月6日，中国农业大学食品科学与营养工程学院杨栋团队在 iMeta 在线发表了题为“ Dietary fiber chemical structure determined gut microbiota dynamics ”的文章。

● 该文章阐明了一种复杂的膳食纤维AssP的化学结构，以AssP或菊粉作为唯一碳源，监测益生菌的体外生长，通过细菌基因组分析，揭示了碳源对肠道细菌的构效调控机制。

●  第一作者：孟欣、郑军

●  通讯作者：杨栋 (dyang@cau.edu.cn)

●  合作作者：王枫乔、郑洁

● 主要单位：中国农业大学食品科学与营养工程学院植物源功能食品北京市重点实验室；美国食品药品监督管理局食品安全与应用营养中心

亮   点

● 阐明一种复杂的膳食纤维AssP的化学结构

● 以 AssP 或菊粉作为唯一碳源，监测益生菌的体外生长情况

● 用 AssP 或菊粉饲喂秀丽隐杆线虫，分析肠道菌群动态变化

● 通过细菌基因组分析，揭示了碳源对肠道细菌的构效调控机制

摘   要

肠道微生物的精确调控需要阐明膳食纤维摄入和肠道微生物群动态变化之间的关系。由于技术限制，目前相关研究并不广泛。本文中，我们使用秀丽隐杆线虫以尽量降低宿主肠道复杂度，来探究膳食纤维化学结构与肠道微生物群动态应答之间的关系。我们阐明了一种复杂的膳食纤维—细香葱茎多糖（AssP）的化学结构，并将其与简单多糖菊粉做对比。体外益生菌生长实验及基因组分析结果表明，与菊粉相比AssP对益生菌的增殖效果更强。用AssP饲喂秀丽隐杆线虫并分析其肠道微生物构成，结果同样表明与菊粉饲喂的线虫相比，AssP饲喂的线虫其肠道微生物群丰富度更高，支持的细菌更多。我们发现，膳食纤维化学结构越复杂，其对肠道细菌的增殖效果越强。这一因素与肠道微生物群间的互作关系协同作用，共同调节了肠道微生物组的动态变化。

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膳食中的碳水化合物包括糖、淀粉和膳食纤维等，是宿主最直接的热量来源。虽然食物中的碳水化合物千差万别，但我们人类的基因组仅能编码17种已知的乳糖、淀粉和蔗糖等消化酶，并没有能够编码膳食纤维消化酶的基因。膳食纤维作为一种聚合物其结构形式多样，不仅具有二级结构，还有结晶形式。人体肠道中的微生物蕴含着大量能够编码膳食纤维感知蛋白和膳食纤维降解酶的基因，是人体基因组相关基因的100倍之多。不同的膳食纤维会诱导细菌表达不同的碳水化合物活性酶以便对其进行利用。大量研究表明，肠道微生物群、膳食纤维和粘液层之间存在着互作关系。肠道微生物群利用膳食纤维所生成的代谢产物也在多方面影响着宿主健康。因此精准补充膳食纤维是一种有前景的通过干预肠道微生物群调节健康问题的措施。许多天然或人造膳食纤维对肠道微生物群的调节作用已经被广泛研究，如纤维素、果胶、II型和IV型抗性淀粉、阿拉伯木聚糖等。目前初步认为膳食纤维的化学结构与肠道微生物群的动态变化有关，因此揭示膳食纤维的特定化学结构与特定肠道细菌之间的关系可以达到预测及调节肠道微生物群的目的。尽管已经有一些关于膳食纤维结构与肠道微生物群动态关系的初步报道，但其详细机制仍然未知。

秀丽隐杆线虫作为动物模型已被广泛运用到多种研究中，包括微生物组研究，如探究宿主-益生菌关系及饮食中微量营养素与共生微生物的相互作用等。与其他动物模型中复杂的肠道分区不同，秀丽隐杆线虫的肠道分区较为简单，这有助于最大限度地降低探究膳食纤维-微生物群关系中的宿主因素。此外，实验室培养的线虫通常在线虫生长培养基（NGM）中培养，以E. coli OP50为食。其食物组成简单，补充膳食纤维作为其附加饮食成分是客观可行的。

探究膳食纤维对宿主肠道微生物群的影响，膳食纤维（尤其是水溶性纤维）的选择十分重要。菊粉对肠道微生物群的调节作用已被报道，且菊粉结构简单，仅由β-2,1-糖苷键连接的果糖构成，因此本研究将其归类于简单膳食纤维。此外，我们选择了细香葱茎部多糖（AssP）作为复杂的膳食纤维进行研究。细香葱茎（Ass）是全世界餐桌上常见的蔬菜和调味品，其单糖成分在本课题组之前的研究中已被报道。本文中，以菊粉或AssP作为唯一碳源进行体外和体内细菌动态变化的相关研究，并结合细菌基因组分析，来确定膳食纤维化学结构与肠道微生物群动态变化之间的关系。

结     果

膳食纤维 AssP 与菊粉的结构差异

我们在之前的研究中已经初步探索了AssP的单糖组成，本文中我们通过结合一维和二维核磁共振光谱（NMR）进一步确定了AssP的结构，特别是其糖苷键组成。在13C谱中存在季碳原子信号δ103.0-103.7，而1H谱中没有末端氢原子信号，这表明存在果糖残基→6)-β-D-Fruf-(2→末端碳信号（图1A和1B）。HMBC谱中，1H信号δ3.58-3.84与C-2的δ103.0-103.7信号相关联，表明存在H-1（图1C）。δ4.09-4.19信号与C-2的δ103.0-103.7信号及C-1的δ61.4、δ60.3信号相关联，表明存在H-3。COSY谱中，δ4.09-4.19信号与δ4.05-3.96信号相关联，表明存在H-4（图S1A）。HMBC谱中，δ4.05-3.96信号与δ81.0-81.3、δ62.2信号相关联，分别指代了C-5和C-6的存在（图1C）。HSQC-TOCSY谱中，13C信号δ81.0-81.3与1H信号δ4.09-4.19、δ3.96-4.05、δ3.78-3.80和δ3.61-3.75相关联，进一步证实了β-D-Fruf（6→2）结构（图1D）。类似地，α-D-Glcp-(1→2)-β-D-Fruf结构也被确定。HSQCED、H2BC、NOESYPHER光谱（图S1B-D）也有助于识别每个残基的化学位移，在表S1中对其进行了总结。通过实验，我们确定菊粉构成为β-2,1-糖苷键连接的果糖（图1E），AssP构成为α-1,2-糖苷键连接的葡萄糖和果糖、β-2,6-糖苷键连接的果糖，以及其它糖苷键连接的半乳糖和阿拉伯糖（图1F）。

图 1. D ₂ O中氘代 AssP 的核磁共振

（A）一维 ¹ H谱；（B）一维13C谱；（C）二维HMBC谱；（D）D ₂ O中氘代AssP的二维HSQC-TOCSY谱，绿色表示葡萄糖残基信号，蓝色表示果糖残基信号；（E）菊粉的化学结构图，即β-2,1-糖苷键连接的果糖；（F） AssP 的化学结构图，即α-1,2-糖苷键连接的葡萄糖和果糖，β-2,6-糖苷键连接的果糖，及其它糖苷键连接的半乳糖和阿拉伯糖

以AssP或菊粉作为唯一碳源监测体外益生菌生长

本文中，我们选择了8种益生菌，分别在以菊粉或 AssP 作为唯一碳源的培养基中培养，并以无碳源的TV培养基作为对照，监测每种细菌在体外的生长情况（图2A）。此外还进行了体内实验，在没有碳源的NGM培养基中添加菊粉、 AssP 或 Ass 作为膳食纤维补充剂饲喂秀丽隐杆线虫，并以无碳源的NGM培养基（Base）作为对照。对秀丽隐杆线虫的肠道微生物群进行测序，以监测不同补充剂下肠道微生物群的动态变化（图2B）。

体外生长实验结果如图2 C-J所示，TV培养基中不添加任何碳水化合物时，所有益生菌均无明显增殖。添加菊粉或AssP后，所有益生菌都能生长且最终生物量和最大生长速度不同（表S2）。本文所使用的8种益生菌中，有5种（ B. breve ATCC 15700、 B. longum ATCC 15707、 L. brevis CICC 6239、 L. rhamnosus ATCC 53103和 L. lactis CICC 23609）在使用 AssP 作为唯一碳源时相较菊粉具有更高的生物量和更大的最大生长速率。这些结果表明， AssP 比菊粉更有利于细菌在体外的生长。

对8株益生菌在不同碳源下的生长模式进行了分析，发现菊粉作为唯一碳源时，8株益生菌会分别聚类。 B. adolescentis 自成一类， L. lactis 和 L. casei 聚类在一起，其余菌株聚类成新组别（图2K）。相反，用AssP作为唯一碳源时，所有益生菌之间的聚类变得不明显。除 B. adolescentis 自成一类外，其余所有菌株都聚集在一起（图2L）。这些结果表明，AssP能够迎合更多益生菌的生长，且DTW聚类不能明确区分它们的生长模式。而利用简单膳食纤维菊粉作为碳源时，细菌表现为具有独特的生长模式。

图 2. 实验设计及体外细菌生长监测

（A）体外细菌生长实验设计。8种益生菌分别在不添加碳源、以菊粉为唯一碳源或以AssP为唯一碳源的TV培养基中培养，监测各个菌株在不同时间的OD595并绘制生长曲线。（B）体内细菌生长实验在秀丽隐杆线虫中进行。在NGM培养基上涂布E. coli OP50作为基础培养基（Base），或在Base培养基中补充菊粉、AssP或Ass。秀丽隐杆线虫在不同的膳食纤维条件下培养15天后，收集线虫、清洗表面、测序进行肠道菌群分析。（C-J）细菌的生长曲线，（C）Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703；（D）Lactococcus lactis CICC 23609；（E）Lactobacillus casei ATCC 334；（F）Bifidobacterium breve ATCC 15700；（G）Lactobacillus brevis CICC 6239；（H）Bifidobacterium longum ATCC 15707；（I）Lactobacillus acidophilus ATCC 4356；（J）Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103。图中黑色表示无碳源培养；红色表示以菊粉作为唯一碳源；紫色表示以AssP作为唯一碳源。生长曲线显示95%的置信区间。热图（K-L）表示以菊粉（K）或AssP（L）为底物时每种细菌生长曲线之间的DTW相关性。

细菌基因组编码指导膳食纤维降解

菊粉和AssP的化学结构已被解析，根据这些信息可以建立膳食纤维化学结构及其增殖细菌之间的关系网络。由于细菌的生长是由细菌基因组和生长介质共同调节的，因此我们对8种益生菌的全基因组进行分析，以寻找细菌基因组和生长介质之间的关联。需要提及的是，本文分析的L. lactis和L. brevis的基因组并非体外实验中所用菌株的基因组，因为实验所用菌株的基因组尚未报道。我们选择了具有已知基因组的相同物种的标准菌株来替代。本文从两个角度对细菌编码的糖苷水解酶基因进行功能分析，包括其能利用的单糖组分及连接这些单糖的糖苷键（图3）。例如，B. adolescentis基因组编码的酶可以破坏α-1,3-、α-1,5-和β-1,2-连接的阿拉伯糖残基，α-1,2-、β-1,2-和β-2,6-连接的果糖残基，α-1,6-和β-1,4-连接的半乳糖残基，α-1,2-、α-1,6-和β-1,6-连接的葡萄糖残基，β-1,4-连接的甘露糖残基，以及β-1,4-连接的木糖残基。同时，从右向左解构图3，我们可以获得膳食纤维的化学结构和可代谢该膳食纤维的相应菌种。菊粉的结构可简化为β-1,2-连接的果糖，而α-1,2-和β-2,6-连接的果糖及α-1,2-连接的葡萄糖可被看作是AssP结构的一部分。对于B. adolescentis，菊粉作为底物支持其生长的基因数量为1，而AssP作为底物支持其生长的基因数量为3。对于L. casei、B. breve、B. longum、L. acidophilus和L. rhamnosus，基因数量分别为1和3、1和3、1和3、2和6、1和3。显然，对于每一种细菌来说，AssP作为底物支持其生长的基因数比菊粉作为底物的基因数多。此外，不同细菌能够利用的糖苷键类型不同。例如，B. adolescentis和B. longum能够水解8种不同类型的糖苷键，而L. lactis只能够利用4种不同类型的糖苷键。与之类似的是，通过某种糖苷键连接的单糖可以满足被某种细菌水解的基因要求，但不一定能满足被另一种细菌水解的基因要求。

此外，用dbCAN元服务器对每个细菌基因组进行碳水化合物活性酶（CAZyme）注释，并结合八种益生菌生长曲线的拟合参数进行分析（表S2）。可以看出，除B. breve外，CAZyme数量和糖苷水解酶（GH）数量与细菌平台期生物量基本呈正相关（图S2A）。对GH的进一步分析发现，GH13、GH 43、GH 1、GH 3和GH 25是益生菌基因组中起主要作用的GH家族（图S2B）。

图3. 膳食纤维的化学结构及其增殖菌的基因组分析

左列：8种典型的益生菌，从上到下依次为：Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703、Lactococcus lactis ATCC 1935、Lactobacillus casei ATCC 334、Bifidobacterium breve ATCC 15700、Lactobacillus brevis  ATCC 14869、Bifidobacterium longum ATCC 15707、Lactobacillus acidophilus ATCC4356、Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103。中列：CAZyme能水解的相应糖苷键，从上到下依次为α-1,2-linkage，α-1,3-linkage，α-1,4-linkage，α-1,5-linkage，α-1,6-linkage，β-1,2-linkage，β-1,4-linkage，β-1,6-linkage，β-1,2-linkage，β-1,4-linkage，β-1,6-linkage和β-2,6-linkage。右列：CAZyme能代谢的相应单糖成分，从上到下依次为阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖。连线的宽度表示CAZyme基因数。从左到右是细菌对其可代谢膳食纤维的基因组分析，从右到左是膳食纤维化学结构增殖特定细菌的对应关系。粉色线表示与菊粉利用有关的基因，紫色线表示与AssP利用有关的基因

膳食纤维结构复杂度影响线虫体内细菌定植

在NGM培养基上涂布E. coli OP50作为基础培养基（Base），或在Base培养基上补充菊粉、AssP或Ass。秀丽隐杆线虫在不同膳食纤维条件下培养15天后，收集线虫清洗表面，并测序进行微生物组分析。由于线虫肠道中的大多数细菌是其食物E. coli OP50，因此在分析前先去除E. coli对应的OTUs。与Base组相比，饲喂菊粉的线虫其肠道可观测OTUs数量无显著变化（图S3A, Kruskal-Wallis检验，P > 0.05）。用AssP饲喂的线虫表现出OTUs数量的显著增加（图S3A，0.001 < P < 0.01）。α-多样性分析中Chao1指数显示，饲喂菊粉未改变线虫肠道菌群的丰富度，而饲喂AssP的线虫肠道菌群丰富度显著高于Base组（图4A, Kruskal-Wallis检验，P < 0.05）和菊粉组（图4A, Kruskal-Wallis检验，0.001 < P < 0.01）。此外，饲喂Ass的线虫肠道菌群丰富度显著低于AssP组（图4A，Kruskal-Wallis检验，P＜0.05）。α-多样性分析中Shannon指数和Simpson指数在各组间差异不显著，这表示补充不同的膳食纤维不影响线虫肠道微生物的多样性和均匀度（图4B，图S3B）。β-多样性分析中，Unweighted_uniFrac PCoA分析显示Base组与菊粉组微生物多样性几乎重叠；AssP组与Base组分开聚类，仅有小部分重叠；而Ass组与AssP组重叠（图4C）。这与β-多样性分析中Bray-Curtis和weighted_unifrac PCoA分析结果基本一致（图S3C和S3D）。用正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）预测样本分类模式。X轴上的T得分表明，Base组、菊粉组、Ass组之间无显著差异，而AssP组和Ass组则相互偏离（图4D）。

Base组和菊粉组的物种组成在目水平上基本相同（图4E），除了饲喂菊粉的线虫肠道中Burkholderiales的相对丰度显著升高（one-way ANOVA，P < 0.05）。此外，AssP组和Ass组的线虫肠道微生物组成与Base组和菊粉组不同。饲喂AssP的线虫肠道中Bacillales的相对丰度显著增加（one-way ANOVA，P < 0.05），而饲喂Ass后，Micrococcales的相对丰度显著升高（one-way ANOVA，P < 0.05），Sphingomonadales的相对丰度降低（one-way ANOVA，P < 0.05）。同样，在科水平上，Base组和菊粉组的物种组成十分相似（图 S3E），除Comamonadaceae的相对丰度显著不同（one-way ANOVA，P < 0.05）。LefSe分析鉴定出22个相对丰度在组间具有显著差异的组别特征菌（LDA score > 4.6）（图4F）。菊粉组中，Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Burkholderiales、Ruminococcaceae、Lactobacillus的相对丰度显著增加，与之前小鼠中相关研究结果一致。

图4. 饲喂不同膳食纤维的秀丽隐杆线虫菌群分析

（A）α-多样性分析Chao1指数；（B）α-多样性分析Shannon指数；（C）PCoA分析unweighted_unifrac距离；（D）OPLS-DA分析。每组包含6个重复。Base组指线虫培养在涂布E. coli OP50 的NGM培养基中；Inu组指在OP50-NGM培养基中补充菊粉饲喂线虫；AssP组指在OP50-NGM培养基中补充AssP饲喂线虫；Ass组指在OP50-NGM培养基中补充Ass饲喂线虫。（C）和（D）图中蓝色表示base组，红色表示菊粉组，紫色表示AssP组，绿色表示Ass组。对于Kruskal-Wallis检验，*表示0.01 < P < 0.05，**表示0.001 < P < 0.01。（E）为线虫菌群在目水平上的物种分类学分布。（F）指LEfSe分析的LDA评分（要求LDA score ˃ 4.6）。（G-J）分别为为Base组（G）、菊粉组（H）、AssP组（I）和Ass组（J）的线虫微生物共生网络。要求Spearman coefficients < −0.8或 > 0.8，且P < 0.05。节点的颜色表示微生物的门水平。红色和蓝色线分别表示正相关和负相关。线的粗细代表其相关强度。（K）体外和体内实验重叠菌属Lactobacillus、Bifidobacterium、Lactococcus的OTUs数量。

复杂的膳食纤维诱导线虫体内出现更多的微生物相互作用

对每个组别中相对丰度在前30的OTUs进行网络分析，以确定它们之间的相互作用。Base组中只有17个OTUs参与了相互作用，其中8个正相关，9个负相关（图4G）。在菊粉组中参与相互作用的OTUs增加到25个，其中24个为正相关，6个为负相关（图4H）。补充AssP后，参与相互作用的OTUs进一步增加到29个，且所有43种相互作用都是正相关的（图4I）。然而，补充Ass后，参与相互作用的OTUs仅有25个，包括27个正相关和1个负相关（图4J）。

比较添加不同膳食纤维后体外益生菌生长和体内线虫肠道菌群动态时，我们发现补充菊粉的线虫与Base组相比，Lactobacillus 和 Lactococcus数量增加（图4K）。补充Ass后，Lactobacillus 和 Lactococcus的数量增加更为明显。补充AssP后，不仅Lactobacillus 和 Lactococcus数量增加，Bifidobacterium的数量同样增加。值得注意的是，Lactobacillus 、Lactococcus和Bifidobacterium覆盖了体外益生菌生长实验中所用的所有细菌属。

讨     论

菊粉作为微生物可利用碳水化合物（MAC），其化学结构简单清晰，由β-D-果糖残基通过β(2→1)糖苷键线性连接构成。本文中我们测定了AssP的化学结构，这种多糖在糖组成及连接它们的糖苷键两个方面比菊粉更复杂。虽然我们的NMR实验并不足以精细地测定出AssP的原子结构，但目前可以确定的是这种膳食纤维主要由果糖和葡萄糖构成，通过α(1→2)和β(2→6)糖苷键连接。因此，将这两种具有不同化学结构的膳食纤维应用于体外和体内细菌生长实验，能在一定程度上为我们揭示膳食纤维与肠道菌群之间的动态关系。

细菌为糖类降解精心设计了数千种不同的酶组合，它们基因上的差异决定了某种细菌更喜欢某种碳源而不是另一种。我们的体外实验数据表明，AssP比菊粉更能迎合细菌的生长，这是由每个细菌的内在基因组决定的。我们的体内实验数据表明，在补充了不同膳食纤维后，线虫肠道菌群仍具有相对稳定的多样性和均匀性。这与之前高纤维补充剂增加了微生物编码的CAZymes，但不增加微生物群多样性的发现一致。此外，与菊粉相比，AssP的存在增加了线虫肠道微生物群的丰富度。菊粉组中，Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Burkholderiales、Ruminococcaceae、Lactobacillus的相对丰度增加，这与之前小鼠相关研究结果一致。此外，补充AssP不仅Lactobacillus和 Lactococcus增加，Bifidobacterium同样增加。体外实验所用到的菌属在体内实验中也显著增加，这种一致性表明体内细菌的生长被其所能获取的膳食纤维的化学结构深刻影响。值得注意的是，虽然研究涉及到了不同的宿主，但这个过程是发生在膳食纤维和肠道细菌之间的，并不涉及宿主因素。因此，我们得出结论，纤维的化学结构越复杂，作为MAC其能增殖的细菌越多。

体外实验培养益生菌时，每个培养基中仅有一种细菌，缺乏细菌之间的相互作用。而体内实验发生在线虫肠道中，显然存在多种细菌之间的相互作用。补充AssP的线虫肠道中微生物互作比例高于Base组和菊粉组。在Base组和菊粉组线虫肠道中，正相互作用的比例较高，同时存在相对频繁的负相互作用。而AssP组中，肠道微生物之间普遍以正相互作用为主导。正相互作用的出现往往伴随着微生物的代谢或微生态环境的脱毒。例如，菊粉的胞外消化有利于肠道细菌Bacteroides vulgatus的增殖，其带来的互惠作用包括增强B. ovatus的生态适应性。因此，膳食纤维被受体微生物利用后产生的底物，可以被其它不能直接利用膳食纤维的细菌所吸收。这表明即使是不能直接利用膳食纤维的细菌，仍然可以从这个过程中获益。化学结构越复杂的膳食纤维，它所能迎合的细菌越多，受体细菌的种类就越多，这一点从正相互作用的增加可以看出。

已有研究提出肠道菌群的精确调控可被用于健康和医疗目的，基本思想是利用多种方法重新平衡肠道内的微生物群。其中最简单、方便的方法就是摄入膳食纤维。然而，利用此方法的限制并不在于阐明对健康具有影响的微生物种类，而是发掘膳食纤维类型及与其相关的肠道微生物群动态变化之间的关系。也就是厘清多种膳食纤维化学结构是如何影响宿主微生物群动态的。菊粉是应用最广泛的膳食纤维之一，可诱发TLR5缺陷小鼠的多发性肝癌，其特征是Proteobacteria丰度升高，这可作为菌群失调和相关疾病的潜在诊断标志。本文中，与Base组相比，菊粉补充组Proteobacteria相对丰度增加，而AssP补充组Proteobacteria相对丰度降低。此外，饮食中的果胶通过增加Firmicutes的相对丰度来改善慢性结肠炎，而我们的研究发现AssP补充组中Firmicutes相对丰度的增加高于菊粉组。以上证据表明，结构复杂的膳食纤维AssP能满足更多细菌的生长，且在体内的益生作用优于菊粉。本文首次阐明了膳食纤维的化学结构与其调节的肠道微生物群动态变化之间的关系，为肠道菌群中食品、营养补充剂和药物干预的应用提供了初步理论指导。

结     论

综上所述，体外培养细菌的基因组分析表明，作为碳源的膳食纤维越复杂，可依赖其增殖的细菌就越多。在不考虑菌群相互作用和基因转移的情况下，在线虫动物模型中同样验证了这种膳食纤维化学结构与细菌生长之间的关系。本研究为肠道菌群的食物、营养补充剂和药物干预奠定了理论基础。

方     法

来自大丽花块茎的菊粉（I811905-250 g，CAS # 9005-80-5）购自麦克林公司（中国上海）。细香葱的葱茎和AssP参考本课题组之前的研究获得。Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703、Bifidobacterium breve ATCC 15700、Bifidobacterium longum ATCC 15707、Lactobacillus acidophilus ATCC4356、Lactobacillus brevis CICC 6239、Lactobacillus casei ATCC 334、Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103和Lactococcus lactis CICC 23609菌株购自北纳生物（中国北京）。

AssP 的核磁共振分析

将AssP溶于3%（w/w）D2O中，反应3小时后冷冻干燥，此步骤重复三次。将氘化的AssP再次溶解在100 mg/ml的D2O中进行NMR测定。在27 °C下，使用具有5mm CPTCI探针的布鲁克NMR仪，于850 MHz（1H）或 212 MHz（13C）采集所有NMR光谱。获得一维1H、13C谱及二维的COSY、edit-HSQC、HSQC-TOCSY、NOESY、HMBC和H2BC谱。16次扫描平均后得到一维1H谱，2048次扫描平均后获得一维13C谱。二维COSY谱以每次递增4次扫描共256次获得，edit-HSQC谱以每次递增8次扫描共256次获得，HSQC-TOCSY谱以每次递增16次扫描共256次获得，NOESY谱以每次递增8次扫描共 256 次获得，HMBC谱以每次递增32次扫描共128次获得。核磁共振实验的弛豫延迟为2秒，TOCSY和NOESY谱的混合时间分别为80和300毫秒。

体外细菌在不同碳源上生长实验

4株Lactobacillus在MRS培养基中37℃厌氧培养16小时，重复3次获得活化菌株。3株Bifidobacterium在含0.5%半胱氨酸的MRS培养基中厌氧培养16小时，重复3次获得活化菌株。上述菌株在充氮的厌氧瓶中培养。Lactococcus lactis在MRS培养基中37℃好氧培养16小时，重复3次获得活化菌株。5000 rpm离心20分钟后收集每种细菌。用含有5%半胱氨酸的PBS缓冲液洗涤收集菌，并再次离心以去除残留的MRS培养基。每种细菌用tryptone-vitamin（TV）培养基悬浮后稀释至OD595为1.0，并加入终体积为40 mL的TV培养基中，在37℃下培养48小时。TV培养基中分别添加0.5%菊粉、0.5% AssP，并有不添加膳食纤维的对照组。用注射器分别在0、2、4、6、8、10、12、24、36、48小时透过密封垫吸取200 μL培养液。用酶标仪记录595 nm下的吸光值（SpectraMax M2e, Molecular Devices, USA）。每组实验重复三次。

体外细菌生长实验数据分析

在GraphPad Prism（version 8.3.0，CA）软件中，用logistic生长模型拟合细菌生长曲线，计算不同碳源下上述各菌株的最大生长速率。每条生长曲线的95%置信区间被绘制为阴影区域。用Python 3.9.5执行动态时间规整分析（DTW）对8种典型益生菌的生长曲线进行聚类。用GraphPad Prism将上述方法得到的DTW距离绘制成热图。

益生菌的基因组分析

Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703、Bifidobacterium breve ATCC 15700、Bifidobacterium longum ATCC 15707、Lactobacillus acidophilus ATCC 4356、Lactobacillus casei ATCC 334和Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103的基因组信息均来自美国菌种保藏中心（ATCC，https://genomes.atcc.org/genomes）。体外实验所用菌L. brevis CICC 6239和L. lactis CICC 23609的基因组信息未查询到，因此用标准菌株L. brevis ATCC 14869、L. lactis ATCC 19435的基因组信息替代。我们检查了每一种益生菌的基因组注释信息，并在综合酶信息系统（BRENDA，https://www.brenda-enzymes.org/）中查询了所有具有EC编号的糖苷酶，以探究每个糖苷酶可以作用的糖苷键和单糖组分。用R v.1.3.1093将收集到的信息绘制成Sankey图。用dbCAN元服务器（http://bcb.unl.edu/dbCAN2/）对每种益生菌的基因组进行注释，以获得CAZyme信息。每株益生菌的所有CAZyme信息都用GraphPad Prism进行整合和图示绘制。

不同碳源下线虫体内微生物群生长实验

将菊粉和冻干的AssP溶于灭菌水中得到100mg /mL的溶液，同时将干燥的细香葱茎磨碎并过200目筛过滤，溶于灭菌水中得到100mg /mL混悬液。将这三种溶液在高压灭菌锅中高温灭菌并铺于含有E. coli OP50的NGM培养基上，37℃孵育5小时。将同步化的秀丽隐杆线虫N2野生型在仅补充E. coli OP50（Base），或额外补充菊粉、AssP、Ass的OP50-NGM培养基上分别培养3-4天，并在膳食纤维消耗完之前将线虫及时转移到新NGM培养基上（添加或不添加膳食纤维）。培养15天后，收集基本处于相同生长阶段的成年秀丽隐杆线虫。用M9缓冲液洗涤3次后，接种到含有100 μg/mL庆大霉素的普通NGM上培养1 小时，以去除表面的细菌污染。再用灭菌水洗涤收集，于-80℃保存，随后进行微生物组测序。

16S rRNA基因测序与分析

对秀丽隐杆线虫菌群进行测序。根据生产商说明，用MO BIO PowerSoil DNA提取试剂盒（No.12888；MO BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA）提取线虫肠道微生物群DNA。用带有条形码的引物（F：5'-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'和R：5'-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）扩增细菌16S rRNA基因V3-V4区。PCR反应组分包括30 ng DNA模版、0.4 μM上下游引物、12.5 μL 2×Taq Plus Master Mix（北京擎科生物技术有限公司），并加水至最终体积为25 μL。PCR反应如下：94℃30秒，50℃30秒，72℃60秒，执行25个循环。PCR一式三份，合并后用2%琼脂糖凝胶电泳纯化，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（AP-GX-250G, Corning, NY, USA）回收DNA。构建DNA文库，用Illumina MiSeq PE300（Illumina, San Diego, CA, USA）进行测序（由北京奥维森基因科技有限公司执行）。

用Trimmomatic（v 0.33）对16S rRNA基因测序数据进行质控处理，根据97%相似度水平对所有序列进行OUT聚类。用SILVA数据库（Release 128, http://www.arb-silva.de）对每个OTU的分类进行分析。通过Qiime2执行α-多样性分析，包括Chao1、observed_OTU、Shannon和Simpson指数及Kruskal-Wallis test结果。Bray-Curtis PCoA分析、Unifrac PCoA分析（包括unweighted和weighted）、OPLS-DA分析、LEfSe分析（LDA得分设置为4.6）、网络分析通过微生态云平台执行（https://www.bioincloud.tech/）。用Gephi v.0.9.2构建微生物相互作用网络。

分别用Shapiro-Wilk检验和Bartlett's检验来检查数据分布的正态性和方差齐性。若数据正态分布且方差齐，则采用单因素方差分析（one-way analysis of variance, ANOVA）及Duncan 's事后检验以评估组间差异的统计学意义。当数据非正态分布或非方差齐时，采用Kruskal-Wallis检验和Dunn’s multiple range 事后检验对数据进行分析。P <0.05为差异显著。所有统计分析均采用Prism 9.0 （GraphPad Software San Diego, CA, USA）进行。

代码和数据可用性

所有测序数据已存入NCBI，BioProject序列号为PRJNA748876（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/）。同时已存入GSA，BioProject序列号为PRJCA012863（https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/browse/CRA008685）。本文所用到的所有数据和脚本保存在GitHub（https://github.com/MencyX/Dietary-fiber-chemical-structure-determined-gut-microbiota-dynamics）。所有补充材料（图表、表格、脚本、图形摘要、幻灯片、视频、中文翻译版本和更新材料）可在线上DOI或iMeta Science（http://www.imeta.science/）中找到

引文格式 ：

Xin Meng, Jun Zheng, FengQiao Wang, Jie Zheng, Dong Yang. 2022. Dietary fiber chemical structure determined gut microbiota dynamics. iMeta e64. https://doi.org/10.1002/imt2.64

孟欣（第一作者）

●  中国农业大学食品生物技术硕士

●  目前研究方向为肠道菌群的精确调控及微生物的垂直传播

郑军（第一作者）

●  中国农业大学食品生物技术硕士

● 现广推科技有限公司数据分析师

杨栋（通讯作者）

● 中国农业大学副教授，博士生导师

● 研究方向为蛋白质折叠和微生态，已在PNAS、Biomaterials、Food Chemistry、iMeta等期刊发表学术论文20余篇，主持国家自然科学基金项目、国家重点研发计划子课题、中科院国家重点实验室开放课题等

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高引文章 ▸▸▸▸

iMeta | 德国国家肿瘤中心顾祖光发表复杂热图(ComplexHeatmap)可视化方法

第1卷第3期

“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百位华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表原创研究、方法和综述以促进宏基因组学、微生物组和生物信息学发展。目标是发表前10%(IF > 15)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！

iMeta主页：http://www.imeta.science

出版社：https://onlinelibrary.wiley.com/journal/2770596x
投稿：https://mc.manuscriptcentral.com/imeta
邮箱：office@imeta.science

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