我们今天介绍的技术允许分析由于内在神经元因素和周围星形胶质细胞的影响而导致的脊髓神经元活动。该技术可靠地产生脊髓特异性的人类神经元和人类星形胶质细胞，并使用可以缩放以实现可重复性的功能输出测量。我们提出的技术允许使用散发性或遗传性疾病患者的神经元来研究脊髓神经元的特定疾病，例如肌萎缩侧索硬化症。

首先，检查人iPSC平板中是否有足够密集的菌落，使得菌落的中心显示分散的白色区域。然后开始包装细胞，用记号笔在板的底部外表面上绘制网格线，以便准确覆盖整个板。在培养罩中使用放大倍数为 10 倍的相衬显微镜，通过用 200 微升移液器吸头手动刮擦来分离分化的菌落。

接下来，用PBS冲洗板两次。然后加入5毫升组织解离蛋白酶在37摄氏度下预热。将细胞在 37 摄氏度下孵育四到七分钟，直到菌落的边缘开始变圆，然后再从平板上提起菌落。

小心吸出解离蛋白酶，并用PBS轻轻冲洗板两次，而不会移位菌落。向培养板中加入5毫升预热的人iPSC培养基。然后用五毫升移液管的尖端从上到下来回划伤整个板，并提起菌落，同时将它们分解成更小的细胞聚集体。

用于将人iPSC分化为神经祖细胞。一旦人类iPSC形成单层并达到90%汇合，就可以按照手稿中的描述开始分化。在第12天，胰蛋白酶处理后，如果细胞未悬浮，则通过以圆周运动将神经诱导培养基从1000微升移液器尖端喷射到细胞上以覆盖整个表面来机械分离细胞。

如果神经祖细胞培养物被冷冻，请解冻它们。如手稿中所述进行培养基交换和PBS冲洗后，用含有0.02微摩尔胞嘧啶阿拉伯糖苷的运动神经元分化培养基更换培养基，然后将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育48小时，当神经胶质承诺祖细胞在有丝分裂后运动神经元祖细胞下出现为单个增殖扁平细胞时， 聚合在细胞簇中。之后，按照手稿中的说明进行了介质交换。

在电镀当天或之前，首先将PLO稀释在水或PBS中，开始涂覆24孔MEA板。然后向每个孔中加入15至20微升PLO，在孔的中心形成液滴，覆盖电极区域，确保不会损坏移液器尖端的电极。向井周围的隔间加水，确保足够的湿度。

并将PLO在37摄氏度下孵育一到两个小时。然后使用塑料微量移液器吸头，在不接触电极的情况下尽可能多地吸出PLO。接下来，用250微升水清洗井三次。

使用移液器吸头，尽可能多地去除水，并在取下盖子的情况下让表面干燥。接下来，加入 15 至 20 微升稀释的层粘连蛋白以覆盖每个电极阵列。向湿度室加水并盖上盖子后，在 37 摄氏度下孵育至少两个小时直至过夜。

在铺板当天，用PBS冲洗运动神经元和星形胶质细胞培养物一次后，加入0.05%胰蛋白酶并在37摄氏度下孵育约5分钟以提升细胞。将细胞收集到含有胰蛋白酶抑制剂的15毫升锥形管中。并用培养基或碱清洗板，以确保收集所有细胞。

通过离心沉淀细胞。然后使用1000微升移液管，用含有20微摩尔ROCK抑制剂的共培养基重悬运动神经元和星形胶质细胞，以产生1毫升单细胞悬液。使用血细胞计数器，计数运动神经元和星形胶质细胞。

在计数时，保持细胞悬浮液并将它们放置在四摄氏度的聚苯乙烯泡沫塑料架中。以300倍G离心一毫升两种细胞悬浮液五分钟。计算所需的体积并重悬颗粒。

以相等的比例合并所需体积的神经元和星形胶质细胞悬浮液，并通过移液两次轻轻混合以彻底混合。然后从板的每个孔中取出层粘连蛋白，并将10微升最终组合的细胞悬液转移到每个孔中，形成覆盖电极阵列的小液滴。将平板与未受干扰的细胞液滴在 37 摄氏度下孵育 20 至 30 分钟，以在平板上形成初始附着。

然后将250微升含有ROCK抑制剂的温热共培养基移液到每个孔的壁上，并在每个孔的对壁上移取相同体积的样品，并将板在37摄氏度下孵育24至36小时。第二天，检查板是否有碎片或死细胞。如果需要，用含有ROCK抑制剂的新鲜共培养基交换培养基。

否则，从共培养第二天开始，使用不含 ROCK 抑制剂的共培养基每周进行两次半培养基置换。要进行记录，请在共培养第一天后尽快开始，将温度设置为 37 摄氏度，将二氧化碳设置为 5%，然后将板转移到记录机中并在记录前平衡至少五分钟。每隔一天或每周记录一次基线活动，超过1至15分钟，具体取决于实验设计。

为了研究靶向神经元或星形胶质细胞的化合物的瞬时电生理效应，请取下板盖，但保持机器盖关闭并记录基线活动至少一分钟。手动打开机器盖而不停止电生理记录，并与适当的药物载体交换25微升培养基。然后手动盖上盖子，并在需要时记录额外的分钟数。

同样，测试感兴趣的药物。在该协议中，hiPSCs作为非融合集落得以维持和传代。神经发生是通过灭活BMP和TGF-β途径通过双重SMAD抑制启动的。

由此产生的神经上皮干细胞分裂并产生多层上皮。早期暴露于神经元生长因子和胶质生成睫状神经营养因子产生了混合的祖细胞群。神经元从这个混合群体中自发出现。

胶质细胞开关通过激活JAK-STAT途径诱导星形胶质细胞分化。经Notch抑制剂处理和分化的运动神经元细胞的脊髓特性由高胆碱乙酰转移酶表达水平支持。在体外培养后第90天，人iPSC星形胶质细胞显示出成熟的表型，如S100 β和GFAP表达所示，而其脊髓区域身份之前由鹰的表达支持。

共培养的细胞自发地与星形胶质细胞重新排列，在底部形成喂养层，在顶部创建连接网络的神经元。单独培养时神经元聚集在大细胞簇中，而人iPSC运动神经元与人iPSC星形胶质细胞共培养导致均匀分布的单层。人iPSC星形胶质细胞增强了人iPSC运动神经元的电生理成熟，如共培养物中更高程度的尖峰和爆发活性所示。

根据我们的经验，干细胞培养和早期鼻咽癌分化是最困难的，对技术错误最敏感。在此阶段，不得以一致和准确的方式执行这些技术，并且几乎没有故障排除的余地。这里描述的共培养技术也可用于其他细胞类型特定的模型。

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