3. 讨论

OA的发生发展涉及复杂的生物学反应 ^{[ 22 ]} 。由于缺乏早期检测和评估治疗结果的有效方法，目前，生物标志物的发现成为辅助疾病监测的前瞻性方法。本研究基于GEO测序数据集，结合机器学习策略，寻找OA新的免疫炎症相关的分子标志物，并在OA患者外周血标本中进行验证，为OA的早期诊断和治疗提供新的思路和研究方向。

在本研究中，通过筛选5个OA软骨细胞全基因组基因表达谱，整合差异表达的lncRNA，确定了105个差异lncRNA，包括30个上调和75个下调的lncRNA。根据adj. P .Val值从小到大排序， 表3 列出前10的lncRNA，包括下调的 NKILA 、 MEG 3和 C 15 orf 54（log ₂ FC<-1），上调的 MIR 155 HG 、 HOTAIR 、 H 19、 LINC 00973、 MEG 9、 PART 1和 C 3 orf 79（log ₂ FC≥1）。 还有一些lncRNA值得关注，如上调的 XIST ^{[ 23 ]} 、 TUG 1 ^{[ 24 ]} 、 DANCR ^{[ 25 ]} 、 MIAT ^{[ 26 ]} ，下调的 MEG 3 ^{[ 27 ]} 、 THRIL ^{[ 28 ]} 、 GAS 5 ^{[ 8 ]} 、 ATB ^{[ 29 ]} 。这些lncRNA可能与OA的发病机制有关。

通过集成3种不同的算法，得到3种算法的重叠基因，分别是 HOTAIR 、 H 19、 MIR 155 HG 和 NKILA 。ROC曲线结果也表明，4个生物标志物 AUC 均大于0.7，表明预测结果具有较强的准确性。 HOTAIR 在OA组织中高表达，通过抑制软骨细胞增殖，促进细胞凋亡和细胞外基质降解导致软骨细胞的功能障碍 ^{[ 30 ]} 。lncRNA NKILA 通过与核因子κB/核因子κB的抑制蛋白（nuclear factor kappa-B/inhibitor of NF-κB, NF-κB/IκB）复合物结合来覆盖IκB的磷酸化位点，从而抑制NF-κB的过度活化 ^{[ 31 ]} 。lncRNA MIR 155 HG 也称为B细胞整合簇。 MIR 155 HG 的表达与免疫细胞、分子和免疫检查点分子的浸润水平显著相关 ^{[ 32 ]} 。 MIR 155 HG 参与破骨细胞的调节。在骨质疏松小鼠中， MIR 155 HG 通过AMP依赖的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）途径靶向瘦素受体基因来抑制破骨细胞活化 ^{[ 33 ]} 。 MIR 155 HG 上调可能是OA炎症过程的重要因素。lncRNA H 19在OA中高度表达，可能通过白介素(Interleukin，IL)-38和IL-36之间的相互作用促进OA中的炎症反应 ^{[ 5 ]} 。综上所述，基于3种算法的机器学习组合模型和文献调研，均表明 HOTAIR 、 H 19、 MIR 155 HG 和 NKILA 与OA中免疫炎症存在相关性，可作为特征性诊断的标志物，但其诊断意义还需要大量的实验来验证。

临床样本验证结果显示，与正常健康组相比， HOTAIR 、 H 19、 MIR 155 HG 相对表达量升高， NKILA 相对表达量下降，结果与生物信息学预测结果相一致，表明本研究整合预测策略的可行性。相关性分析显示4个特征性lncRNA与免疫炎症指标的相关性。IL-6在软骨病理的发展中起着关键作用，OA患者血清或滑液中IL-6水平的增加与疾病的严重程度相关；然而，IL-6也增加了抗分解代谢因子的表达，具有保护作用；表明IL-6在OA中起双重作用，可能是由IL-6经典与反式信号传导的不同效应引起的 ^{[ 34 ]} 。IgE介导的肥大细胞通过高亲和力IgE受体（FcεRI），导致促炎细胞和降解介质（包括类胰蛋白酶）的释放，导致组织损伤、炎症和肥大细胞活化，导致OA的发展和进展 ^{[ 35 ]} 。CRP和ESR可作为炎症反应的非特异性指标 ^{[ 36 ]} 。研究发现CRP是影响OA诊断和严重程度分级的独立因素 ^{[ 37 ]} 。免疫球蛋白亚型在OA患者血清中表达升高，参与了OA发病过程 ^{[ 38 ]} 。例如，IgA ^{[ 39 ]} 和 IgM ^{[ 40 ]} 作为机体内高亲和力抗体，参与免疫应答反应。相关性分析也表明， MIR 155 HG 、 NKILA 、 HOTAIR 与炎症指标（CRP、ESR和IL-6）、免疫指标（IgE、IgA和IgM）存在相关性，表明特征性的lncRNA参与了OA的免疫炎症反应，在OA临床患者应用中有重要意义。

本研究预测的结果来源于GEO数据库多个实验测序数据的组合，多个算法整合机器学习策略来识别特征性基因，信息利用度方面较单个数据集和小样本的实验验证更全面和完善。然而，本研究存在一定的局限性：样本量相对较小，软骨标本难获取，因此选择外周血标本进行验证。此外，OA患者之间的个体差异，包括社会经济地位、疾病严重程度和疾病持续时间，可能会影响结果的准确性。因此，进一步大样本的体内外实验验证特征性的lncRNA在OA免疫炎症中的确切机制将是我们下一步研究的目标。

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作者贡献声明 刘健负责论文构思，忻凌负责正式分析，周巧和齐亚军负责调查研究，周巧、方妍妍和胡月迪负责可视化，周巧负责初稿写作和审读与编辑写作。所有作者已经同意将文章提交给本刊，且对将要发表的版本进行最终定稿，并同意对工作的所有方面负责。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

安徽省高等学校科学研究项目（自然科学类）重点项目（No. 2022AH050449）、安徽省第12批“115”创新团队（皖人才办〔2019〕1号）、安徽省名中医刘健工作室建设项目（中医药发展秘〔2018〕11号）和安徽省中医药领军人才项目（中医药发展秘〔2018〕23号）资助

References