Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthet

Introduction

Nanocarriers 允许控制交付小和大分子货物, 包括活跃实体, 如果不封装, 将是高度降解和/或太疏水性, 以管理 在体内 。nanocarrier 的形态通常是捏造的, 类似于脂质体 (也称为 polymersomes) 的聚合物泡, 提供了同时负载亲水性和疏水货物 ¹ ^, ² 的能力。尽管他们有很好的优势, 但 polymersomes 在临床应用方面仍不多见, 部分原因是他们的制造业面临一些关键挑战。对于临床使用, polymersome 配方需要在大规模, 不育, 和一致的批次。

一些技术可以用来形成 polymersomes 从两嵌段共聚物, 如聚乙二醇-聚 (丙烯硫化物) (PEG- 苯硫醚), 包括溶剂分散 ³ , 薄膜补液 ¹ ^, ⁴ , 微流体 ⁵ ^, ⁶ , 直接水化 ⁷ 。溶剂分散在有机溶剂的存在下需要长时间的潜伏期, 这可能变性一些生物活性有效载荷, 如蛋白质。薄膜补液不提供对形成的 polymersomes 的多分散性的控制, 通常需要昂贵和耗时的挤出技术, 以达到可接受的单分散性。此外, 微流体和直接水化都很难扩大到较大的生产量。在不同的 nanocarrier 制造方法中, 闪光 nanoprecipitation (FNP) 提供了大规模和可再生配方 ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰ 的能力。虽然 FNP 以前是为制备固体核纳米粒子而预留的, 但我们的实验室最近扩大了 FNP 的使用范围, 包括了各种不同的 PEG -苯硫醚纳米结构形貌的一致形成 ¹¹ ^, ¹² , 包括 polymersomes ¹¹ 和 bicontinuous 球 ¹² 。我们发现, FNP 是能够形成单分散配方的 polymersomes 不需要挤出, 导致优越的多分散性指数值与非挤压 polymersomes 形成的薄膜补液和溶剂分散 ¹¹ . 尽管在许多溶剂条件下形成了 FNP ¹² , 但 Bicontinuous 球的大疏水域却无法通过薄膜补液形成。

在这里, 我们提供了一个详细的描述, 以合成的 PEG- bl -PPS 两嵌段共聚物用于 polymersome 的形成, 密闭撞击射流 (CIJ) 混合器用于 FNP, FNP 协议本身, 并实施一个自动化系统, 以减少用户的可变性。包括关于如何充分消毒系统以产生体内使用的无内毒素制剂的信息, 以及关于 FNP 形成的 polymersomes 的代表性数据。有了这些信息, 有兴趣的读者在体外和体内工作中使用 polymersomes 将能够制造出他们自己的无菌, 单分散配方。具有 nanocarrier 配方和高分子合成专业知识经验的读者将能够使用 FNP 作为现有配方技术的潜在替代品, 快速测试自己的聚合物系统。此外, 本文所描述的协议可作为 nanocarriers 在纳米技术实验室课程中的应用的教育工具。

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Protocol

1. 聚 (乙二醇)- 块状聚 (丙烯硫化物)-硫醇的合成

合成甲氧基聚乙二醇甲磺酸 (锰: 750) (MeO-PEG ₁₇ -毫秒) 。

将10克的 MeO ₁₇ -OH 在200毫升100% 甲苯内溶解在 3-脖子圆底烧瓶 (RBF) 下的磁性搅拌在 600 rpm。

将3颈部 RBF 连接到一个系在冷凝器上的迪恩-斯塔克装置, 使整个系统处于惰性气体, 无论是氮气还是氩气。

将3颈 RBF 在油浴中, 加热到165摄氏度, 同时搅拌 600 rpm。

用共沸蒸馏去除微量水和100毫升甲苯。

从油中取下3颈部 RBF, 在保持惰性气体条件的同时, 分离出院长-斯塔克装置, 并允许冷却至室温。

加入5.6 毫升100% 三乙胺 (3 摩尔 eq) 和300毫升的无水100% 甲苯到 MeO-PEG _{溶液, 同时搅拌在 17 rpm。}

将3颈 RBF 移动到冰浴中, 保持 600 rpm 和惰性气体条件下的搅拌。

稀释3.1 毫升100% 甲磺酰基氯 (3 摩尔 eq) 在30毫升100% 甲苯, 慢慢增加到3颈部 RBF 通过添加漏斗, 而搅拌在 600 rpm。

在惰性条件下, 在室温下600转一夜搅拌。

过滤解决方案通过一个傅书礼漏斗填料与硅藻土 (见 材料表 ), 以消除盐。

通过旋转蒸发器去除甲苯, 将水浴设置为40摄氏度, 旋转120转, 压力设置为50-100 毫巴。

重新溶解产品在200毫升100% 二氯甲烷 (DCM), 并通过一个傅书礼漏斗填充硅藻土地球 (见 材料表 )。

通过旋转蒸发器拆卸 DCM, 将水浴设置为40摄氏度, 旋转120转, 压力设置为450-600 毫巴。

谨慎地重新溶解产品在 100% DCM 和慢慢地沉淀产品通过加入它滴状 (通过巴斯德吸管) 到500毫升冰冷100% 二乙基醚。保持搅拌在 300 rpm。

醒酒或抽吸从沉淀产物中除去二乙基醚, MeO ₁₇ -甲磺酸, 并在真空干燥过夜, 完全干燥。

立即使用产品, 或在惰性气体下贮存数月-20 摄氏度。

合成甲氧基聚乙二醇硫代乙酸 (MeO-PEG ₁₇ -钽, II .)。

将5克 MeO-PEG ₁₇ -毫秒 (I) 分解为3颈 RBF, 在200毫升100% 无水甲基酰胺 (DMF) 中, 在惰性气体下以 600 rpm 的室温搅拌。

添加2.5 克100% 碳酸钾 (3 摩尔 eq) 搅拌溶液。
注: 碳酸钾不会在溶液中完全溶解。

稀释1.3 毫升100% 硫代乙酸酸 (3 摩尔 eq) 在100毫升100% 无水 DMF, 并添加滴状到溶液通过一个加法漏斗。
注: 硫代乙酸酸有强烈的, 不高兴的气味。在处置或清洁之前, 必须小心地将所有脏东西放在化学油烟机内过夜。

在室温下一夜之间用力搅拌 (rpm 600 或更大)。
注: 盐的形成可以很容易地破坏这个溶液的搅拌。必须注意保持夜间搅拌。

过滤解决方案通过一个傅书礼漏斗填充硅藻土地球 (见 材料表 )。

通过旋转蒸发器将 DMF 移除, 水浴设置为60摄氏度, 旋转 120 rpm, 压力设置为5-15 毫巴。

将产品溶解在100毫升的100% 四氢呋喃 (THF) 中, 加入含有中性氧化铝的柱体, 以除去红/橙色杂质。

拆卸 THF 通过旋转蒸发器与水浴设置为40°c, 旋转 120 rpm, 压力设置为200-300 毫巴。

在 100% DCM 中谨慎地重新溶解产品。如果盐沉淀形成, 过滤溶液通过6微米孔径滤纸使用傅书礼漏斗。

缓慢沉淀的产品通过通过巴斯德吸管添加滴到500毫升冰冷100% 乙醚, 搅拌在 300 rpm。乙基醚可能需要进一步冷却到-20 °c 在一个防爆冷藏库几个小时, 如果沉淀不崩溃的解决方案在4摄氏度。

醒酒或抽吸从沉淀产物中除去二乙醚, MeO-PEG17-Thioacetate。在真空干燥中隔夜贮存产品, 随后在惰性气体下-20 摄氏度。

合成两嵌段共聚物聚 (乙二醇)- 聚 (丙烯硫化物)-硫醇 (PEG ₁₇ - bl -PPS ₃₅ -SH, III .)。

将 MeO-PEG ₁₇ -钽 (II) 在10毫升100% 无水的 DMF 内溶解在氩气 Schlenk 瓶内, 同时在室温水浴中搅拌 400 rpm。

添加1.1 摩尔甲醇钠 (0.5 米溶液甲醇), 允许搅拌在 400 rpm 5 分钟。

添加35摩尔 eq 100% 丙烯硫化物, 迅速, 以解决。允许在 400 rpm 10 分钟内搅拌。

添加10摩尔 eq 的100% 冰乙酸, 允许搅拌在 400 rpm 5 分钟。

通过旋转蒸发器将 DMF 移除, 水浴设置为60摄氏度, 旋转 120 rpm, 压力设置为5-15 毫巴。

在 100% DCM 中节约产品, 在80毫升100% 甲醇中沉淀, 在两个50毫升锥形离心管之间分离。

离心圆锥管在 7500 x g 5 分钟在4摄氏度。吸走上清。

贮存产品, PEG ₁₇ - 苯硫醚 ₃₅ SH, 隔夜在真空干燥, 随后惰性气体在-20 摄氏度。

2. 通过手动闪光 Nanoprecipitation 组装 PEG Nanocarriers PPS

选消毒密闭撞击射流 (CIJ) 搅拌机。

在生物安全柜 (BSC) 内, 所有部件的浸入式混合器在0.1 米氢氧化钠中一夜之间拆卸。

重新组装 CIJ 搅拌机, 通过鲁尔锁注射器在无内毒素水中流动。

测试水的 ph 值, 并继续流经水, 直到 ph 值寄存器为中性。

将 PEG ₁₇ - bl -PPS ₃₅ -SH 聚合物和疏水性货物溶于 THF (撞击液 1)。

将20毫克的 PEG ₁₇ - bl -PPS ₃₅ -SH 的重量分为1.5 毫升管。

添加疏水性染料 ( 例如, DiI, 的), 药物 ( 如雷帕霉素), 或其他货物。
注: 货物可能是干的, 或溶解在水混溶溶剂, 最好 THF。如果货物不溶于 THF 或 DMF, 则可以使用另一种水混溶溶剂, 但要谨慎, 因为聚合物不太可能溶解。可以装载的货物数量取决于货物的性质 ( 例如, 分子量、疏水性、立体考虑), 并应按个案依据 ¹¹ ^、 ¹² 进行探讨。

添加500µL 100% THF 聚合物和货物, 漩涡大力溶解。

在水缓冲器中溶解亲水性货物 (撞击液 2)。为此, 根据需要, 将亲水性的货物溶解在500µL 水缓冲器 ( 如磷酸盐缓冲盐水、纯净水等 ) 的聚合物囊中。

将缓冲区添加到库中。

添加2.5 毫升的水缓冲选择 ( 例如, 1x 磷酸盐缓冲盐水) 到适当大小的水库 ( 例如, 20 毫升玻璃闪烁瓶)。将水库放在 CIJ 搅拌机下, 使搅拌机的流出物直接进入水库。

负载撞击解决方案成单独的1毫升塑料一次性注射器。

相互撞击解决方案, 同时形成纳米结构并将其加载到有效载荷下。

将注射器插入 CIJ 搅拌机顶部的鲁尔锁适配器中。

在一个单一的, 平滑的, 快速的运动, 同时压低两个注射器和同等的力量。
注: 如果执行多个顺序 impingements, 首先在空储层中收集流出。

选执行多个 impingements。在两个注射器之间分裂新生的纳米结构溶液, 重复步骤 2.6. 1-2. 6.2 4 多次。

收集在2.4.1 中制备的含水缓冲油藏的流出物, 轻轻搅拌以确保混合。

卸下已卸载的货物和有机溶剂。

(备选案文 1)透析 nanocarrier 配方在同一水缓冲用于撞击和在水库, 使用适当的兆瓦截止管至少24小时, 至少2缓冲变化。这可以在室温下进行。
注: Nanocarriers 将保留的油管与兆瓦截止 < 10万 kDa, 并可能会保留的更高的下限以及。此选项在使用无菌缓冲的平衡计分卡时保持不育。

(备选案文 2)采用 1x PBS 作为水缓冲器, 通过尺寸排除或脱盐/缓冲交换柱 ( 例如, 琼脂糖6B 柱) 筛选配方。
注意: 此选项在平衡计分卡上执行的一列已彻底灭菌的情况下保持不育。

(备选案文 3)用真空干燥一夜之间去除挥发性有机溶剂。

(备选案文 4)过滤器配方使用一个切流过滤系统使用 50-100 kDa 过滤器在20-60 毫升/分钟流速15分钟到1小时, 取决于 unencapsulated 货物的分子量被净化 (较大的货物将需要更长的时间)。

选集中 nanocarrier 配方。

(备选案文 1)集中使用自旋浓缩器系统 ( 例如, 与兆瓦截止 > 10万的自旋柱), 按照制造商的描述使用。
注: Nanocarriers 可能需要在旋转之间悬浮, 并且可能需要大量的旋转以集中到所需的体积。自旋浓度可减少 nanocarrier 制剂的不孕。

(备选案文 2)使用真空干燥减少体积。
注意: 在这些条件下, 体积变化难以控制, 必须注意保持渗透前后的浓度。

商店 nanocarriers 在4摄氏度, 数周至数月。贮存前使用后, 简要涡 nanocarrier 配方。

3. Nanocarrier 配方的特点
测量加载效率

如果货物是荧光或强烈吸收在特定波长以外的 260-450 nm, 测量荧光/吸光度使用 fluorimeter/分光光度计。
注: PEG- 苯硫醚吸收从 260-310 nm 和 polymersome 配方吸收从310-450 毫微米, 这可能会复杂化的定量的货物, 吸收在类似的波长。

如果货物在 260-450 nm 范围内吸收并具有亲水性, 则通过将配方的 25 ul 添加到相等体积的 1% H ₂ O ₂ 或1% 海卫 X-100, 从而扰乱 PEG-苯硫醚纳米结构, 随后分离并区分通过高效液相色谱 (HPLC) 与水缓冲器兼容的尺寸排除柱 ( 例如, 琼脂糖6B 柱) ¹¹ , 从聚合物吸光度中分离出的货物。

如果货物在 260-450 nm 范围内吸收, 并可溶于 THF 或 DMF, 则 lyophilize 在1.5 毫升塑料管中冻结 100 ul, 一夜之间以-80 摄氏度为配方。然后把管子放进玻璃真空容器里, 放到冻干机上。允许24小时的冻干发生, 并随后重新溶解在 50 ul 的 DMF 或 THF 之前的分离和检测通过 HPLC。
测量 nanocarrier 尺寸和形貌
使用动态光散射 (dl) ¹¹ 或纳米粒子跟踪分析 ¹³ 测量 nanocarrier 大小。
注: 从 PEG ₁₇ - bl -PPS ₃₅ -SH 形成的 Nanocarriers 预计将有一个平均直径在100-200 毫微米之间, 与多分散性指数 < 0.3。

用低温透射电镜 (cryoTEM) 测定 nanocarrier 形态 ¹⁴ 。
注: 从 PEG ₁₇ -苯硫醚 ₃₅ SH 形成的 Nanocarriers, 预计将是聚合物囊泡 (polymersomes), 具有明显的可分辨的聚合物膜和主要球形形状。
选内毒素试验配方
(备选案文 1)使用一种基于细胞的化验方法来检测内毒素, 例如, 未加工的蓝细胞或 HEK 蓝 TLR4 细胞 (见 材料表 ), 如制造商所描述的, 无论是定量或定性的脂多糖 (LPS) ¹³ .

(备选案文 2)使用鲎鲎裂解 (拉尔) ¹⁵ 化验试剂盒, 如制造商所述。

4. FNP 高速注射器泵的研制

制造自定义仪表组件。
注: 在辅助材料中提供了用于加工所有自定义零件的3D 模型。

机器多层仪表底盘从¾ "丙烯酸板材和装配 (参见 补充文件 1-5 )。
注: 丙烯酸耐化学性差。如果该仪器使用苛刻的溶剂, 机器的基础, 从金属认为适合的应用。

3D 打印与聚乳酸 (PLA) 塑料印刷件。

打印注射器排出 (SE) 2 部分设备: SE 部分 1-后方 FNP 块持有马车 ( 图 5F , 灰色部分; 补充文件 6 )和 SE 2 部分-前驱逐指南 ( 图 5F , 黑色部分; 补充文件 7 )。有关图表, 请参见 辅助文件 2 。

打印红外线传感器大括号 ( 图 5I , 黑盒; 补充文件8和 9 )。

选打印双注射器柱塞支架。

将仪表机箱层与 M5 六角螺栓固定在一起, 并将橡胶脚添加到底座上。

配置单板计算机与 Raspbian GNU/Linux 8.0 (杰西) 操作系统 (基于 Linux Debian)。
注: 本仪器可根据要求提供操作软件。可根据要求提供仪器软件源代码。在接收压缩文件时, 下载自述文件中指定的所有依赖项。该软件包括一个简单的图形用户界面, 可以控制仪表操作, 包括基本运行参数 (马达速度, 方向等 )。鼓励用户在现有的源代码和程序定制模块上扩展, 以便在他们自己的实验中使用。所有软件都是使用 python 2.7.12 编写的, 目前与 python 3 不兼容。使用 RPi、PicoBorgRev、kivy 和多处理模块。自述文件包含有关软件分发许可证的详细信息。

安装 24 V 拉丝直流电机 ( 图 5A ) 和精密滑轨 (4.5 英寸 (114.3 毫米) 冲程; 1.27 mm 螺杆引线) ( 图 5C )。
注: 在这里使用的 24 V 直流电机有一个 rpm _最大 , I _最大 , 和全负荷扭矩的 4252 rpm, 4.83 a, 和 ~ 0.2 N m, 分别。

选在电机下方放置填料, 以抑制操作过程中的震动。
注: 建议切割2-3 毫米厚的橡皮垫, 以适应仪器底座的马达托架尺寸。

将精度幻灯片装入仪器底座。

暂时卸下螺纹杆。

安装幻灯片使用两个 #8-32 平机螺丝。

采用螺杆束联轴器 (1-1/4 "长度), 包含 6/16" 和 1/4 "直径镗孔, 将直流电机安装到精密滑轨上。
注: 根据用于机械仪表底座的丙烯酸的厚度, 可能需要垫片来使马达和精密滑动轴水平。

从金属板和 L 形角括号装配排料平台 ( 图 5D )。使用 #6-32 螺钉将底座金属平台安装到滑动平台上 (连接到螺纹杆)。有关安装限制的详细信息, 请参阅制造商提供的精确幻灯片示意图。

组装注射器排出系统设置。

将直线运动枕块 (安装平台 + 直线运动轴承) 连接到 M8 镀铬不锈钢导轨上 (在 图 5 中可以很容易地观察到平行钢轨)。

线导轨通过直线轴导轨/支承和锁轨。每条导轨使用三个导轨。使用 M4 机螺钉将 SE 部件1和2安装到枕头块上。

松散地加入 SE 零件1和2与 M8 六角螺栓。配置 SE 部分1和2之间的空间与螺旋压缩弹簧覆盖每个螺栓之间的安全两个向内面对尼龙套管 (见 图 5F )。在 se 部分1和 se 2 部的外部安装这些套管。

导线电路 (参见 图 6 为核心接线图)

将马达控制器连接到 I2C/SDA、3.3 V 和单板计算机上的接地销上。

将直流电机端子连接至电机控制器板的 m 和 m + 块。将 24 v、2.5 电源 ( 图 5B ) 连接到电机控制器的 V + 和接地块 (控制器被封装在最终设计中的一个简单电子框中, 见 图 5H )。

将马达控制板的3V3 和5V 针脚连接到单板计算机上的相应针脚上。分别将电机控制器的可调性和 SCL 销连接到单板计算机的针脚3和5。
注: 命令由单板计算机通过马达控制器向直流电机发出。通过脉冲宽度调制, 通过调节电机端子的电压来控制电机转速。在此设置中, 通过24伏直流电机 (全负载安培数: 4.83 a) 的最大电流被限制为 2.5 a, 由24伏电源供电。建议电机电路通过正常闭合 (NC) 紧急停止 ( 图 5J ) 进行连接。这样做提供了中断电机电路以启用基本紧急关机操作的方法。

将前、后红外线接近传感器 (数字距离传感器, 图 5I ) 连接到 RPi GPIO 针脚24和23分别。

通过仪器底座上的导管传送传感器布线。
注: 红外传感器为非接触式断裂光束运动传感器, 检测范围为2-10 厘米。

4.7.4.2 将有线红外传感器连接到3个 d 打印的红外线传感器支架 ( 图 5I 、黑匣子) 并安装到仪器底座上。当正确设置为大括号, 传感器的脸应该向外凸出从14毫米 x 7 毫米矩形开口的支撑。
注: 这些传感器大括号可以暂时安装使用尼龙搭扣或粘合剂 (临时安装是有用的, 以适当调整和优化红外传感器放置)。或者, 通过在仪器底座上钻小导孔并用 M2 螺钉固定大括号来永久安装。

将7英寸触摸屏液晶显示器连接到单板计算机的5V、地线和显示串行接口 (DSI) 针脚。7 "RPi 和 LCD 显示组件如 图 5G 所示。

5. 使用特制的高速注射器泵, 通过 FNP 制造 Polymersomes

(备选案文 1)使用自动运行模式。

从主菜单中选择 " 自动运行 "。系统将提示用户允许马达自动定位注射器排出平台到精确幻灯片的开始。确保在进行之前, 在金属板的前面和后面的路径是明确的。

载入1毫升塑料注射器, 如第2.5 节所述, 并将注射器安装在 CIJ 搅拌机的雌性鲁尔连接器上。负载 CIJ 搅拌机 (附注射器) 进入后排排车厢的矩形开口 (见 图 5E )。

使用 GUI 中的滑块设置所需的马达速度 (单位: rpm) (有关重要注意事项, 请参阅下面的说明)。最佳的电机速度取决于特定的泵和设置, 但必须确保至少1毫升/秒的流量为 CIJ 混频器通道尺寸提供这里。
注: 在设置流速时, 请考虑以下事项。在垂直手工操作的 FNP 配置中, 反应物被从注射器中排出的速率为1毫升/秒, 但当手驱动时, 可高度可变。这仅仅是通过注射器桶的流量, 这是由用户提高注射器柱塞的速度控制。注意, 1 毫升/秒速率不是指从较小直径喷嘴的出口流量。在上述指定的通道尺寸, 应保持1毫升/秒, 以确保适当的雷诺的数值为湍流混合 ¹⁰ 。只要调整通道直径以维持雷诺支持湍流条件的数字, 就可以使用不同的流速。注射器活塞是先进的垂直金属板, 移动沿高精度铝滑动耦合到 24 V 拉丝直流电机。在这种配置中, 最大桶流速率受多种因素的影响, 包括 (1) 最大电机转速 (4252 rpm) 和精密滑轨 (1.27 mm) 的螺杆引线耦合到电机轴 (2) 电机的扭矩 (~ 0.2 N m 的全 load 扭矩), 这是需要克服阻力 (3) 背压贡献从流体进入和退出的 CIJ 搅拌机, (4) 使用注射器的强度 (用户应注意的力量作用在注射器, 并使用注射器适当的力量)。对于点 (2), 当增加流量时, 需要足够的扭矩, 以避免停滞电机, 同时保持稳定的驱逐在不断增加的背压。桶流量--为了说明上述系统能达到的桶流量, 请考虑使用载入两个单毫升注射器的反应物进行 FNP 的情况。为了达到1毫升/秒的流量通过枪管, 电机必须推进金属板的距离定义的活塞长度 (~ 68 毫米为一个典型的毫升注射器) 在一秒钟。提供了精密滑动的 1.27 mm 螺杆引线, 它遵循的是一个直流电机运行在 4252 rpm 能够推进平台高达 ~ 90 毫米/秒 (71 转速/秒 * 1.27 毫米/转速)。这相当于一个桶流率为1.3 毫升/秒, 超过1毫升/秒的目标速率。

在运行该仪器之前, 检查系统以确保平台的路径没有障碍物, 前端和后部红外线接近探测器是否有障碍物 (红外传感器是精确滑动附近的小黑盒终端见 图 5I )。还要确保 CIJ 搅拌机的毛细管管出口被路由到适当的收集容器 (如: 玻璃烧杯等 )。

要从注射器中排出反应物并进入 CIJ 混合器, 请按软件界面中的 " 运行 " 按钮。

(备选案文 2)使用手动运行模式。请参阅上面的 自动运行模式 方向, 并注意以下对步骤5.1.5 的更改: 按下通过运行完成而连续按下的前进按钮 ( 即, 平台对按下事件的响应, 以及马达将停止响应释放事件)。

(备选案文 3)使用手动平台定位模式;这种模式允许用户通过运行电机低速 (20% 电源), 以响应软件接口上的正向和反向按钮, 定位平台。

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Representative Results

在这里, 我们提出了一个简单的协议, 以制定 nanocarriers 能够装载亲水性和疏水的货物, 是安全的 在体内 鼠标和非人类灵长类管理 ¹¹ ^, ¹³ 。我们还包括了在我们的代表性结果中使用的聚合物合成的详细协议, 以及为 CIJ 搅拌机中的机械控制的解决方案制造一个定制仪器的描述。 图 1 提供了用于生产 PEG ₁₇ - bl -PPS ₃₅ SH 的合成步骤的概述, 该两嵌段共聚物用于自组装 polymersome nanocarriers。 图2所示 的是 FNP 协议, 用于装配 polymersomes 和/或成像代理加载的 PEG-苯硫醚-PPS。该聚合物被冲击在一个 CIJ 搅拌机 ( 图 3a 所示的示意图, 最初描述在 ¹⁰ ), 形成单分散 polymersomes 作为骨料形态, 可以验证的动态光散射 (dl) 和低温透射电镜 (cryoTEM) ( 图 3b -3c) 。由 FNP 形成的 Polymersomes 变小 ( 图 3d ) 和更多单分散 ( 图 3e ) 与随后的 impingements, 并且可能被装载与亲水性和疏水的货物 ( 例如, 做亲脂染料, 小分子治疗、蛋白质等 ; 图 4a )。在上述不育条件下形成的 Nanocarriers 是无内毒素, 由原蓝和拉尔内毒素化验, 从而适用于广泛的体外和体内应用 ( 图 4b , 数据没有显示)。

最后, 我们设计和建造了一个仪器来机械控制的流量和造成的冲击, 解决方案在 CIJ 搅拌机 ( 图 5 )。这种仪器的创建是必不可少的, 因为商用注射器泵无法达到 FNP 所需的流速。除了定制修改, 商用注射器泵的速度限制, 他们使用低速步进电机, 这是设计, 以可靠地分配流体缓慢和稳定的方式。在我们的仪器中, 反应物排出是控制在一个 24 V 拉丝直流电机控制下的精确滑动, 它可以达到更大的速度 (4252 rpm) 比在商用注射器泵发现慢步进电机。在单板计算机上运行的自定义软件用于操作仪器 ( 图 6 )。除了3D 型号的零件外, 还提供了2D 图纸。所有的图纸和模型都是在 FreeCAD (开源参数化 3D CAD 建模软件) 中创建的, 以确保它们能够被研究界高度访问。用于操作该仪器的软件是用 Python 2.7.12 编写的, 允许快速开发定制的 FNP 程序, 以确保适合性一致 nanocarriers (尺寸、形貌等 ) 的生产。该仪器的操作软件将根据要求提供。用户应该注意到软件目前不兼容 Python 3;但是, 这可能会在将来的更新中改变。该仪器通过控制反应物的排出速率, 消除了人工操作中人为误差的变化。

图1。PEG ₁₇ -苯硫醚 ₃₆ -SH 合成的合成方案. 请单击此处查看此图的较大版本.

图2。生产 polymersomes 通过 FNP 在手驱动 CIJ 搅拌机。 用 FNP 形成 polymersomes 的示意图。PEG-苯硫醚聚合物与疏水性货物一起溶解于有机溶剂中, 并对溶解亲水性货物的水溶剂进行冲击。快速混合发生在 CIJ 搅拌机流可以反复撞击或允许通过稀释在一个水溶剂的储层来完成形成过程。请单击此处查看此图的较大版本.

图3。FNP 形成的 polymersomes 的表征。(a) 本研究使用的 CIJ 搅拌机的设计示意图。所有测量都以毫米为单位。 (b) FNP 在1和 5 impingements 后形成的 polymersomes 的大小分布, 由 dl 测量。n = 6 公式化, 样品的平均是图表。 (c) polymersomes 1 和 5 impingements 后形成的 cryoTEM 图像, 通过 CIJ 混合器, 缩放条 = 100 nm。FNP 形成的 polymersomes 的直径 (d) 和多分散性指数 (e) , 由 dl 测量。为了比较, 还测量了由薄膜补液 (tf E) 或无 (tf) 后挤压形成的 polymersomes, 并用溶剂色散 (SD) 形成, n=3, 误差条代表标准偏差。Subfigures (c )- (e) 征得艾伦等的许可。 ¹¹ . 请点击这里查看这个数字的更大版本.

图4。加载效率和内毒素特征。(a) 小型和大分子在 polymersomes、n=3、误差条中的加载效率代表标准偏差。 (b) 未育 FNP、n=6、polymersomes 形成的未加工的蓝脂多糖测定标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.

图5。CIJ 混合器中溶液撞击的机械控制仪器. (a) 24 V 拉丝直流电机。 (b) 供电 (24 V, 2.5)。 (c) 4.5 "冲程精密滑轨与1.27 毫米螺钉引线 (连接到电机轴由螺杆束耦合)。 (d) 由矩形金属板和 L 形角括号构造的驱逐平台。 (e) CIJ 搅拌机。 (f) 驱逐马车。 (g) 单板电脑和 7 "触摸屏"。 (h) 封装在塑料外壳上的 mMotor 控制板 (83 毫米 x 53 毫米 x 35 毫米)。 (i) 红外传感器 (非接触式断裂光束运动传感器)。 (j) 紧急停止按钮 (NC)。请单击此处查看此图的较大版本.

图6。核心接线图. 将显示单板计算机、马达控制器和红外传感器之间的主要连接。此处不显示 LCD 触摸屏连接, 因为此组件是非必需的 (用户可能选择使用标准的计算机监视器和鼠标)。注意, 在显示的配置中, 24 V 马达电源和单板计算机电源是分开的。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

我们提供了详细的指示, 以快速制造 polymersomes 使用 PEG ₁₇ - bl -PPS ₃₅ -SH 作为两嵌段共聚物。水泡 polymersomes 是在亲水性 PEG 和疏水性 PPS 块分子量的比值下组装的主要骨料形态。当撞击多次, 他们有一个直径和多分散性匹配 polymersomes 挤出通过200纳米膜后, 通过薄膜水化形成。因此, 该协议消除了在制造单分散 polymersome nanocarriers 过程中需要额外的挤出步骤。Polymersomes 通过 FNP 负载的亲水性和疏水性的货物, 并保持这些分子的生物活性通过配方过程 ¹¹ 。附加的议定书被描述为确保不育必要时, 允许形成无内毒素的 polymersome 配方, 因此适用于生物化学和免疫学化验以及安全的 体内管理 .手工操作的 CIJ 混合器是简单的设置和提供易用性的用户, 但引入潜在的质量控制问题, 由于用户的变异性。为了保持流的一致性, 我们试图创建一个能够实现和重现性保持可比流量的仪器。重要的是, 在上述指定的通道尺寸, 商用注射器泵不能达到足够高的流量 (约1毫升/秒) 由于配备了低速步进电机。为解决这一问题, 并对流量进行更大的控制, 对 FNP 高速注射器泵的制作进行了描述。注意使用开源和易于定制的系统操作系统和代码软件。

对替代流量的控制提供了调整 nanocarrier 配方的潜力, 并为进一步探索各种 nanocarrier 形态的组装提供了机会。雷诺数和相应的混合时间以前被证明对通过 FNP ⁹ 形成的固体核 nanocarriers 的大小有影响, 但不清楚它对 polymersomes 的形成有什么影响。这是当前调查的一个话题, 目前的推荐率是0.5 到2毫升/秒, 具有代表性的结果在大约1毫升/秒。为了进一步提高对流量的控制, 可能需要更换基于 Linux 的操作系统, 并对注射器泵马达进行实时控制。

除了调整流量之外, 还有许多方法可以将此 FNP 协议修改为套件特定的需求或应用程序。可以使用更小或更大数量的聚合物。浓度低至1毫克/毫升和高达100毫克/毫升已被用来形成稳定的 nanocarriers。较大的体积可能被用于撞击, 虽然在手驱动的 FNP 的压力的一致应用是更困难的体积大于1毫升每注射器。水库的容积也可以修改。最终有机: 超过1:3 的水溶剂比可能导致 nanocarriers 的不完全形成, 因此, 在不确认 nanocarriers 的形成的情况下, 应注意不要减少储层的体积。当试图装载高浓度的疏水货物时, 可能会发生聚集, 这通常可以通过提高聚合物的摩尔比: 货物来减轻。

另一个有待探索的课题是进一步扩大 FNP polymersome 的形成, 包括其他聚合物系统, 除了 PEG-苯硫醚。事实上, 其他系统以前已经用于形成胶束和固体核药物 nanocarriers ¹⁶ ^, ¹⁷ 。然而, 还不清楚是否有一组参数可以通过 FNP 使用其他聚合物系统导致 polymersomes 的形成。考虑到潜在变量的数量, 完全有可能其他聚合物可以通过 FNP 形成 polymersomes 或其他软 nanoarchitectures, 如流量、温度、溶剂选择和聚合物浓度。

与所有的配方技术一样, FNP 和限制可能使某些应用程序站不住脚。快速混合过程要求有机和水溶剂混溶, 这就排除了使用一些常用的溶剂溶解许多两嵌段共聚物, 例如二氯甲烷和氯仿。有些聚合物如果不能溶解在水混溶的有机溶剂中, 那么就可能与 FNP 不相容。这里描述的 FNP 协议使用1:1 的有机溶剂比, 这可能会减少对高浓度有机溶剂, 如一些生物活性蛋白敏感的有效载荷的活性。应该指出的是, 对生物活性的影响将取决于蛋白质, 因为我们以前发现, 对碱性磷酸酶的酶活性的影响, 在 polymersomes 后, FNP ¹¹ 。多入口涡旋混合器 ¹⁸ 是一个更昂贵, 但更可定制的 FNP 平台, 提供额外的控制有机和水溶剂的比例, 提供了一个通用的替代 CIJ 搅拌机, 为这些情况下。

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Disclosures

作者声明他们没有竞争的财政利益。

Acknowledgments

我们承认西北大学结构生物学设施的工作人员和仪器支持。右侧西北大学综合癌症中心和西北大学结构生物学设施的支持。加坦 K2 直接电子探测器购买了由芝加哥生物医学财团提供的资金在芝加哥社区信托基金的支持。我们还感谢西北大学的下列设施: 凯克跨学科表面科学设施、结构生物学设施、生物成像设施、高级分子成像中心和分析Bionanotechnology 设备核心。这项研究得到1453576国家科学基金会资助, 国家卫生研究院主任的新创新奖 1DP2HL132390-01, 再生纳米医学催化剂奖和2014麦考克催化剂奖的中心。全国卫生研究院 predoctoral 生物技术培训补助金 T32GM008449 部分支助了该基金。

Materials
Company Catalog Number Comments CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - 32 GB Edition CanaKit UPC 682710991511 Linear Bearing Platform (Small) - 8mm Diameter Adafruit Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric kit11868 Linear Rail Shaft Guide/Support - 8 mm Diameter Adafruit Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity McMaster-Carr 5236A16 MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor Iron Horse MTPM-P10-1JK43 Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display Raspberry Pi B0153R2A9I (ASIN) PicoBorg Reverse - Advanced motor control for Raspberry Pi PiBorg BURN-0011 Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm Pololu Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque Ruland PSR16-5-4-A Polyethylene glycol monomethyl ether Sigma Aldrich 202495 Methanesulfonyl chloride Sigma Aldrich 471259 Toluene Sigma Aldrich 179418 Toluene, Anhydrous Sigma Aldrich 244511 Triethylamine Sigma Aldrich T0886 Celite 545 (Diatomaceous Earth) Sigma Aldrich 419931 Dichloromethane Sigma Aldrich 320269 Diethyl ether Sigma Aldrich 296082 N,N-Dimethylformamide, anhydrous Sigma Aldrich 227056 Potassium carbonate Sigma Aldrich 791776 Thioacetic acid Sigma Aldrich T30805 Tetrahydrofuran Sigma Aldrich 360589 Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I Sigma Aldrich 199974 Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol Sigma Aldrich 403067 Propylene sulfide Sigma Aldrich P53209 Acetic acid Sigma Aldrich A6283 Methanol Sigma Aldrich 320390 Sodium hydroxide solution 1.0 N Sigma Aldrich S2770 Endotoxin-free water GE Healthcare Life Sciences SH30529.01 Paper pH strips Fisher Scientific 13-640-508 Endotoxin-free Dulbecco's PBS Sigma Aldrich TMS-012 Borosilicate glass scintillation vials Fisher Scientific 03-337-4 1 mL all-plastic syringe Thermo Scientific S75101 Sepharose CL-6B Sigma Aldrich CL6B200 Liquid chromatography column Sigma Aldrich C4169 CIJ mixer, HDPE Custom
References

Stano, A., Scott, E. A., Dane, K. Y., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. Tunable T cell immunity towards a protein antigen using polymersomes vs. solid-core nanoparticles. Biomaterials . 34 (17), 4339-4346 (2013).

Discher, B. M., et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers. Science . 284 (5417), 1143-1146 (1999).

Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O'Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture. ACS Nano . 6 (9), 7850-7857 (2012).

Yi, S., et al. Tailoring Nanostructure Morphology for Enhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis. ACS Nano . 10 (12), 11290-11303 (2016).

Shum, H. C., Kim, J. W., Weitz, D. A. Microfluidic fabrication of monodisperse biocompatible and biodegradable polymersomes with controlled permeability. Journal of the American Chemical Society . 130 (29), 9543-9549 (2008).

Pessi, J., et al. Microfluidics-assisted engineering of polymeric microcapsules with high encapsulation efficiency for protein drug delivery. International Journal of Pharmaceutics . 472 (1-2), 82-87 (2014).

O'Neil, C. P., Suzuki, T., Demurtas, D., Finka, A., Hubbell, J. A. A novel method for the encapsulation of biomolecules into polymersomes via direct hydration. Langmuir . 25 (16), 9025-9029 (2009).

Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today . 11 (2), 212-227 (2016).

Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Physical Review Letters . 91 (11), 118302 (2003).

Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences . 101 (10), 4018-4023 (2012).

Allen, S., Osorio, O., Liu, Y. G., Scott, E. Facile assembly and loading of theranostic polymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation. Journal of Controlled Release . 262 , 91-103 (2017).

Bobbala, S., Allen, S. D., Scott, E. A. Flash nanoprecipitation permits versatile assembly and loading of polymeric bicontinuous cubic nanospheres. Nanoscale . 10 (11), 5078-5088 (2018).

Allen, S. D., et al. Polymersomes scalably fabricated via flash nanoprecipitation are non-toxic in non-human primates and associate with leukocytes in the spleen and kidney following intravenous administration. Nano Research . , (2018).

Karabin, N. B., et al. Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology. Nature Communications . 9 (1), 624 (2018).

Mascoli, C. C., Weary, M. E. Limulus amebocyte lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral injectable products and medical devices: advantages to manufacturers and regulatory officials. Journal of the Parenteral Drug Association . 33 (2), 81-95 (1979).

Pustulka, K. M., et al. Flash nanoprecipitation: particle structure and stability. Molecular Pharmaceutics . 10 (11), 4367-4377 (2013).

Tang, C., Amin, D., Messersmith, P. B., Anthony, J. E., Prud'homme, R. K. Polymer directed self-assembly of pH-responsive antioxidant nanoparticles. Langmuir . 31 (12), 3612-3620 (2015).

Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures. Langmuir . 24 (1), 83-90 (2008).
问题 138 nanocarrier 闪光 nanoprecipitation 嵌段共聚物
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Allen, S., Vincent, M., Scott, E. Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation. J. Vis. Exp. (138), e57793, doi:10.3791/57793 (2018).
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快速, 可伸缩的组装和负载的生物活性蛋白和免疫增强剂到不同的合成 Nanocarriers 通过闪光 Nanoprecipitation

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