单颗粒冷冻电镜分析已成为结构生物学家工具箱中的常规技术，适用于各种标本，包括膜蛋白、淀粉样原纤维、核酸结合蛋白和病毒。一旦样品制备完成并将网格加载到显微镜中，就可以在许多冷冻电镜设施（如Astbury生物结构实验室和eBIC）中远程进行数据收集。成功确定结构的主要障碍通常在于样品制备和网格筛选阶段，有时需要通过该过程进行多次迭代。

在这里，我们将演示远程网格筛选和单粒子数据采集。在显微镜用户界面的自动加载器选项卡中，使用箭头显示选项对话框，然后按下库存按钮。这将依次检查磁带中的每个位置，以确定是否存在墨盒。

库存将按顺序在每个插槽上运行。映射所有已占用的插槽后，库存将停止。突出显示要传输到显微镜柱的网格并单击加载。

一旦网格成功加载到舞台上，插槽标签将从蓝色变为黄色。要筛选网格，请打开 EPU 软件。在准备页面上，选择采集光学元件和设置，然后从下拉菜单中选择图集预设。

选择适当的光束设置预设，然后按下设置将参数推送到显微镜。按下以打开柱阀并插入流感屏幕。检查光束是否可见，并且是否充分扩散和居中以覆盖探测器。

如有必要，请使用操纵杆或虚拟手面板导航到网格的较薄区域，以控制 X 和 Y 中的舞台移动。抬起流感屏幕并使用 EPU 中的预览按钮拍摄图像。在 EPU 中，转到地图集页面并按新会话。选择 MRC 图像格式并输入合适的文件夹名称和位置以保存筛查会话，然后单击应用。

从左侧菜单中选择筛选。勾选每个网格旁边的复选框以获取地图集蒙太奇，然后在EPU中开始放映会话。为每个检查的格网获取一个地图集，并在完成后列出可用的格网方块。

每个地图集都可以通过在筛选页面上突出显示来查看。完成后，查看收集的图集，并确定适合在较高放大倍率下评估样品质量的网格。在 EPU 筛选菜单上突出显示所选网格，然后单击加载样本。

从地图集筛选菜单中，选择当前加载的网格，并通过右键单击网格图像上的所需位置并在此处选择移动舞台，将舞台移动到包含填充孔的网格正方形。返回到 EPU 准备页面，然后选择网格方形预设。打开EPU自动功能页面，并使用网格方形预设运行按阶段倾斜自动真心，将样品移动到真心高度。

在 EPU 准备中，拍摄新的网格正方形预览图像。请注意不同孔的灰度值，表示不同的冰厚度。使用右键单击将舞台移动到孔上，并将舞台移动到此处。

选择孔或真心高度预设，然后单击预览。选择数据采集预设并设置放大倍率，以便轻松识别颗粒。将散焦偏移设置为负三到五微米。

迭代步骤以重新评估整个网格中颗粒分布，方向和污染的冰厚度范围。根据显微镜的可用性，继续直接进行数据收集，或者可以从显微镜中取出网格，以便将来收集，包括在其他地点。如果筛选中无法使用地图集，请通过设置地图集设置并选择网格来获取地图集，以收集地图集。

获取地图集并单击网格位置以查看输出。地图集完成后，根据项目的实验需求定义每个光束设置预设。执行图像偏移校准。

通过选择 EPU 页面会话设置，然后从首选项中选择新会话或新会话来设置 EPU 会话。选择新会话后，将出现一个弹出窗口，提供使用以前设置的选项。这些设置将自动从上一个 EPU 会话加载到当前 EPU 会话。

或者，从首选项中选择"新建"，然后选取具有已保存首选项的文件，以将此信息预加载到当前 EPU 中。在会话名称中填写信息丰富的内容。在类型中，选择手动。

对于采集模式，如果可用且需要无像差图像偏移采集，请选择精确的孔对中或更快的采集。选择所需的映像格式，然后选择存储文件夹，EPU 将创建一个具有会话名称的目录。根据使用的栅格孔间距选择适当的栅格，然后按 Apply 键。

选择初始网格方块并设置采集模板。转到正方形选择。如果所有方块均为绿色，请单击左上角的"全部取消选择"。

通过右键单击并选择"打开磁贴"来打开磁贴。添加或选择网格正方形，方法是单击"选择"，然后右键单击并选择"将舞台移动到网格正方形"。转至孔选择，然后按自动右心键。

等到拍摄出网格正方形图像。如果自动功能失败，这可能是因为高度明显偏离。它可以使用网格方形放大倍率的流感屏幕手动调整。

要测量孔的大小，请移动并调整黄色圆圈，使它们以正确的大小和间距覆盖孔。按查找孔。检查是否正确找到孔。

如果没有，请更改孔的大小，然后再次按"查找孔"。如果此过程始终失败，请考虑在网格方形放大倍率下移动到较小的数字或更亮的光斑大小。使用右侧的过滤器冰质量直方图来调整孔的选择。

这可用于排除厚冰和薄冰的区域。对于在会议期间选择的未来网格方块，将记住这一点。使用顶部选择菜单中的工具优化孔选择。

例如，单击"移除靠近栅格栏的孔"。转到模板定义，然后按"获取"。单击"查找"和"居中孔"。

将阶段移位后的延迟和图像移位后的延迟时间更改为一到五秒，然后，如果可用，请根据需要检查最大图像移位值。单击添加采集区域，然后单击图像上的任意位置。将采集区域移动到所需位置。

在右上角添加散焦范围。膜蛋白项目的典型散焦列表是负0.8到负三微米散焦，然后添加其他采集区域，使它们的采集区域不会与光束一起双重暴露。单击添加自动对焦区域，然后单击图像上的任意位置。

将自动对焦区域移动到孔周围的碳纤维上。标准做法是在使用AFIS或每5至15微米对中后自动对焦，具体取决于整个正方形的Z高度变化。单击添加漂移测量区域。

每个网格方块执行一次漂移测量，设定阈值为每秒0.05纳米作为标准设置。漂移测量区域可以直接与自动对焦区域重叠。确保漂移和自动对焦区域均不与采集区域重叠。

返回到正方形选择，然后在网格上选择要采集的正方形。使用采集区域的数量和预期的数据采集速率来预测需要多少个采集区域。选择所有所需的方块后，按"准备所有方块"。

收集每个正方形后，在网格正方形之间导航并使用选择画笔微调孔。移动到试样上方的载物台位置，并使用自动功能设置真心高度。使用显微镜软件执行显微镜对准，如前所述和文本中所述。

在重新插入物镜光圈并将其居中并使用EPU校正物镜散光之前，在自动功能中执行无昏迷对齐。确保两种对齐方式都收敛于合适的值。在开始自动采集运行之前，请确保关闭自动装载机涡轮泵，并在需要时插入物镜孔径。

在自动采集中，按"开始运行"以开始自动数据采集。使用该协议，可以在图集阶段筛选和丢弃损坏或干燥的网格。在大多数网格上观察到冰的梯度。

在筛选过程中，理想的颗粒分布是单分散的，可以看到一系列颗粒取向。如果冰太薄，当用电子束照射时会融化，导致显微照片中的过度运动。当缓冲液中有洗涤剂时，最常观察到这种情况。

冰必须是玻璃体的，因此排除了网格中大多数图像显示结晶冰的区域。包括数据的图形摘要，以评估显微照片质量并决定是否需要对数据收集进行修改。诸如crYOLO之类的粒子拾取器对于数据的首次传递效果足够好，从而可以进展到2D类平均。

应选择显示二级结构细节的类进行 3D 分析，而应丢弃垃圾颗粒。粒子子集可用于生成用于 3D 分类和细化的初始模型。在RagAB的情况下，数据集包含三个不同的符合性，可以在3D分类过程中分离。

重要的是要记住，数据采集和后续图像分析步骤的成功取决于在筛选阶段获得和识别优化良好的网格。获得3D EM密度图后，可以通过拟合和细化蛋白质模型或从头开始构建原子模型来进一步解释它。Cryo-EM单颗粒分析能够对许多目标进行结构化测定，这在以前是不可能的。

值得注意的是，这些工作流程最近已被用于解决COVID-19相关大分子的结构。

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