2. 肿瘤突变负荷及基因突变修复能力

肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）是指每百万碱基中被检测出的体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数。理论上TMB越高，新的肿瘤相关抗原的产生就越多，就越有可能刺激产生免疫应答，配合抑制性免疫信号的解除，治疗效果会越好 ^{[ 13 ]} 。错配修复基因（mis-match repair, MMR）编码的蛋白与基因的错配修复有关。MMR功能缺陷造成微卫星不稳定（microsatelliteinstability, MSI）和体细胞基因变异得不到修复，TMB也就会高。MSI本身就是一种带有微卫星变化的基因超突变状态。通常而言，绝大部分MSI-H的样本，TMB也较高，但反之则不一定成立。鉴于MMR、MSI和TMB三者之间的相互关系，三者均有作为免疫检查点抑制剂治疗标志物的理论可行性。

TMB检测的方法是基因组分析，方法包括全基因组测序、全外显子测序和选择性基因测序，有研究认为不同大小的测序组合会影响TMB准确度。TMB的cut-off值以及不同瘤种间是否存在差异还没有统一的标准，目前普遍认同 < 6 mutations/Mb定义为TMB低，≥20 mutations/Mb定义为TMB高。

基因分析发现，在肺癌中携带下述基因变异的患者，TMB更有可能高： RRM1 、 TP53 、 FANCE 、 NEIL1 、 POLE 、 POLG 、 FANCE 、 GEN1 、 RPA1 。而NSCLC中有确定药物治疗靶点突变的患者，如 EML4-ALK 融合、 EGFR 突变、 ROS1 重排、 BRAF 融合等，通常TMB表达较低。

一项研究纳入了147例肺癌患者，检测450个基因包括全部外显子及部分内含子。结果发现 KRAS 突变组的TMB值（中位TMB=10.6）明显高于野生型组患者（中位TMB=4.6， P =0.027）。 EGFR 突变组的TMB值明显低于 EGFR 野生型组（中位TMB=8.4， P =0.034）。TK融合组的TMB中位值为6.5，与其他组没有显著差异。15% EGFR 野生型组患者的TMB值> 20，而只有6% EGFR 突变组患者属于高TMB ^{[ 14 ]} 。

鉴于全外显子测序（whole exome sequencing, WES）价格昂贵，Chen等 ^{[ 15 ]} 比较了目标基因组分析（targeted genomic profiling, TGP）和WES对27例NSCLC患者TMB的分析，发现TGP（811个基因）和WES结果具有高度一致性（R ² =0.71, P < 0.05）。同时发现 MMR 基因突变仅发生在高TMB的患者（错配修复基因为 MSH2 、 PMS2 ）。对使用了Pembrolizumab治疗的34例患者进行评估，发现使用TGP及WES进行疗效预测的AUC分别为0.80、0.84。这些结果说明，TGP可以替代WES作为TMB检测技术。对8例患者的肿瘤组织及ctDNA同时检测TMB，发现结果也高度一致（ R ² =0.80, P < 0.05），说明可以考虑选择无创的液体活检替代有创的组织活检。

Iijima等 ^{[ 16 ]} 的研究也得到了相同的结论，14例接受nivolumab治疗的患者，在治疗前及治疗后的1周、2周、4周、6周、8周抽取外周血进行53个目标基因进行二代测序并与组织进行比较，结果发现高TMB患者用药2周内就可根据突变等位基因频率（mutation allelic frequency, MAF）下降情况判断疗效。

3. 肿瘤驱动基因突变

除研究总的基因突变状况与免疫治疗有效性的关系外，人们也期望能发现某个驱动基因的突变能够预测免疫治疗的有效性。有研究 ^{[ 17 , 18 ]} 表明 EGFR 突变或ALK重排的NSCLC患者使用PD-1/L1无效，机制尚不清楚。Liu等 ^{[ 19 ]} 的研究纳入745例患者，分为EGFR/ALK阳性组（344例）和EGFR并ALK阴性组（401例）。阳性组5.52% PD-L1 ⁺ /CD8 ⁺ ；11.92% PD-L1 ^- /CD8 ⁺ ；18.90% PD-L1 ⁺ /CD8 ^- ；63.66% PD-L1 ^- /CD8 ^- 。EGFR并ALK阴性组13.97% PD-L1 ⁺ /CD8 ⁺ ；6.98% PD-L1 ^- /CD8 ⁺ ；30.42% PD-L1 ⁺ /CD8 ^- ；48.63% PD-L1 ^- /CD8 ^- 。结果发现EGFR/ALK阳性患者PD-L1 ⁺ /CD8 ⁺ 对较低而PD-L1 ^- /CD8 ^- 则明显较高。EGFR/ALK阳性组患者的亚组5年生存率存在明显差异（PD-L1 ⁺ /CD8 ⁺ : 41.9%, PD-L1 ^- /CD8 ⁺ : 91.0%, PD-L1 ⁺ /CD8 ^- : 75.4%, PD-L1 ^- /CD8 ^- : 69.7%, P =0.003）。然而在EGFR并ALK阴性组差异则不显著（PD-L1 ⁺ /CD8 ⁺ : 66.5%, PD-L1 ^- /CD8 ⁺ : 76.9%, PD-L1 ⁺ /CD8 ^- : 62.3%, PD-L1 ^- /CD8 ^- : 70.6%, P =0.341）。但是使用Nivolumab治疗患者，虽然 EGFR 突变阳性患者疗效不佳，但是仍有部分患者明显获益，具体机制尚需进一步研究 ^{[ 20 ]} 。

4. 免疫效应标志物

PD-1/PD-L1免疫治疗，是解除免疫抑制从而提高效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，以达到控制肿瘤的目的。所以，假设治疗有效，那么T细胞活化的下游一系列炎症因子理论上都应该升高，例如IFN-γ、TNF-α、IL-6等，所以，炎症因子可能是预测免疫治疗的标志物。

一项研究入组了17例NSCLC和21例黑色素瘤、接受nivolumab治疗的患者，发现INFγ与PFS、OS、疾病控制率（disease control rate, DCR）相关，INFγ中、高水平组PFS显著高于低表达组（5.1个月 vs 2.0个月， P =0.012, 4），两组的OS虽然没有统计学差异，但中、高水平组要长于低水平组（10.2个月 vs 4.9个月， P =0.068, 7） ^{[ 21 ]} 。另有研究 ^{[ 22 ]} 表明，使用nivolumab或pembrolizumab的NSCLC患者，治疗1周内血清IL-6、CRP升高组有效率显著高于未升高组，而TNF-α升高组患者，未表现出显著的有效率。

Kowanetz认为效应T细胞（T-effector, Teff）的基因表达（gene expression, GE）情况可以反映免疫抑制剂治疗前的免疫状态。作者分析了753例使用atezolizumab的NSCLC患者的Ⅲ期临床试验（OAK）的结果。将 PD-L1 、 CXCL9 、 IFNγ 这3个基因作为Teff的标志，检测Teff GE，同时检测肿瘤组织PD-L1的表达情况。结果发现，Teff GE越高，PFS获益越显著。用Teff GE的中位值将患者分组，高表达组的PFS显著高于低表达组（HR=0.73, 95%CI: 0.58-0.91）。作者同时认为，使用Teff GE来预测atezolizumab的疗效较PD-L1更为敏感，因为目前数据显示使用Teff GE来预测，50%的患者可以有PFS的获益 ^{[ 23 ]} 。

5. 血细胞计数

除以上指标外，血细胞计数等常规实验室指标在预测免疫治疗疗效方面也有较好效果。本次大会有多项研究对此进行了报道。

一项研究回顾性分析了134例晚期或者复发使用Nivolumab的NSCLC患者，分析患者实验室化验的常规指标，包括：中性粒细胞绝对计数（absolute neutrophil count, ANC）、淋巴细胞绝对计数（absolute lymphocytes count, ALC）、单核细胞绝对计数（absolute monocytes count, AMC）、嗜酸性粒细胞绝对计数（absolute eosinophil count, AEC）、CRP以及乳酸脱氢酶水平。多因素分析结果表明，低水平ANC、高水平ALC、高水平AEC是较好的PFS、OS的独立相关因素。将以上3个指标做不同分组分析，全部符合3个条件的患者预后最好，仅符合一个条件的，预后最差，中位PFS分别是209 d、87 d、42 d，药物有效率分别为43.5%、27.1%、5.9% ^{[ 8 ]} 。另外一项研究，应用免疫抑制剂治疗2个周期后，ANC < 4, 000患者的OS明显延长（NR vs 4.9个月， P =0.02）。ALC升高患者的DCR有所增加（147 vs 155, P =0.05）。该研究还同时发现，肺腺癌患者肿瘤组织中TTF1表达水平与免疫治疗有效率相关（88% vs 45%, P =0.03），ALC≥1, 000患者的TTF1阳性率更高（82% vs 45%, P =0.05） ^{[ 24 ]} 。一项应用nivolumab的研究发现，19例患者治疗前低水平ANC、中性粒细胞、淋巴细胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio, NLR）和血小板、淋巴细胞比值（platelet lymphocyte ratio, PLR）生存期更长，治疗过程中NLR升高反映疾病进展 ^{[ 25 ]} 。

Soyano等 ^{[ 26 ]} 的研究纳入了157例应用nivolumab或pembrolizumab的NSCLC患者，结果表明治疗前高水平的ANC、AMC、NLR、MLR患者的预后更差。治疗前ANC/ALC≥5.9患者的死亡风险及疾病进展风险均显著高于ANC/ALC < 5.9患者（HR=1.65, 95%CI: 1.06-2.56, P =0.027）（HR=1.65, 95%CI: 1.17-2.34, P =0.005）。治疗前MLR≥11.3组患者死亡风险更高（HR=2.13, 95%CI: 1.32-3.44, P =0.002）。

6. 综合分析模型

以上单一标志物的应用并不十分理想，目前有研究将涉及PD-1疗效的影响因素综合起来设计成数学模型来提高预测免疫治疗效果的准确性。

一项研究 ^{[ 27 ]} 将使用PD-1抗体的NSCLC患者提取361份关注区域（region of interest, ROIs）样本和254, 205个细胞核，总结出一个新型的数字病理系统，用以预测使用PD-1抗体的疗效。系统通过计数肿瘤的ROIs的细胞核的形态特征，包括大小、圆度、周长等与平均值或标准制定差异以及核内部特征（主要是染色质结构）就可以预测疗效。作者认为，细胞核的形态学特征要比多形性及异质性测量数据（pleomorphism and heterogeneity measurement data, CFLCM）还要重要。虽然本次分析的样本量不足够，结果稳定性可能受到影响，但是作者认为针对病理组织使用计算机系统进行预测疗效是可行的。

Wungki等 ^{[ 13 , 28 ]} 则将性别（Sex）、ECOG评分、中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）、治疗后NLR减治疗前NLR（Delta NLR=DNLR）等参数设计成iSEND计算模型，将使用nivolumab的患者进行验证，发现评分好的患者预后好，PFS分别为17.4个月 vs 5.1个月（HR=0.32, 95%CI: 0.20-0.50, P < 0.000, 1）。

7. 展望

免疫检查点抑制剂治疗肿瘤其效果除与肿瘤细胞免疫抑制信号的解除有关外，还与肿瘤免疫刺激信号强弱、免疫效应细胞功能的发挥及其他免疫抑制信号途径的活动有关，机制相对复杂，找到单一标志物有效筛选敏感患者的可能性较低。因此，该领域的研究重点一是寻找更适合的标志物，例如一项入组504例鳞癌及522例腺癌患者的研究发现，不论何种病理类型，EAM相关的基因过度表达均可以导致CD4/CD8 T细胞下降和B/Treg细胞增加，影响免疫治疗疗效 ^{[ 29 ]} ；二是利用大数据进行更深的挖掘，从而建立综合预测模型，多维度预测治疗敏感性。另外，对标志物检测技术和判别标准的统一化也很有必要。

References