免疫组库测序分析新生儿脓毒症患者外周血T细胞受体β链CDR3的多样性

Diversity of the T cell receptor β chain complementarity-determining region 3 in peripheral blood of neonates with sepsis: an analysis based on immune repertoire sequencing

黄循斌 , ¹ ^{叶淑珍

,
¹

邬吉伟

,
¹

符青松

,
¹

刘碧华

,
¹

丘惠娴

,
¹
and

程国强

²}

黄循斌

深圳市龙岗中心医院新生儿科, ，广东 518116

Find articles by 黄循斌

叶淑珍

深圳市龙岗中心医院新生儿科, ，广东 518116

Find articles by 叶淑珍

邬吉伟

深圳市龙岗中心医院新生儿科, ，广东 518116

Find articles by 邬吉伟

符青松

深圳市龙岗中心医院新生儿科, ，广东 518116

Find articles by 符青松

刘碧华

深圳市龙岗中心医院新生儿科, ，广东 518116

Find articles by 刘碧华

丘惠娴

深圳市龙岗中心医院新生儿科, ，广东 518116

Find articles by 丘惠娴

程国强

复旦大学附属儿科医院新生儿科, 深圳市龙岗中心医院新生儿科, ，广东 518116

复旦大学附属儿科医院新生儿科, 201102

程国强 ，男，主任医师。Email： moc.361@mcgnehcqg 。

\bar{x} \pm s

）表示，组间比较采用两样本 t 检验；偏态分布的计量资料以中位数（范围）表示，组间比较采用Mann-Whitney U 秩和检验；计数资料以例数和百分率（%）表示，组间比较采用检验。 P <0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 一般情况

12例脓毒症新生儿纳入研究，其中男7例，女5例；胎龄37 ⁺³ ~39 ⁺⁵ 周，出生体重2 560~3 800 g，日龄7~27 d。对照组9例中，男5例，女4例，胎龄38 ⁺¹ ~39 ⁺³ 周，出生体重2 585~3 835 g，日龄9~26 d。两组患儿性别、胎龄、出生体重、日龄的比较差异均无统计学意义（ P >0.05）。见表1 。

表1

病例组与对照组新生儿的基本情况比较

组别	例数	性别(男/女, 例)	胎龄( $\bar{x} \pm s$ , 周)	出生体重( $\bar{x} \pm s$ , g)	日龄[中位数(范围), d]
对照组	9	5/4	38.4±1.4	3 542±492	15(9~26)
病例组	12	7/5	38.7±1.2	3 270±544	13(7~27)
/ t / Z 值		-0.016	-0.383	1.180	0.231
P 值		0.899	0.706	0.253	0.751

Open in a separate window

12例脓毒症新生儿血培养致病菌情况：大肠埃希菌3例，无乳链球菌2例，溶血葡萄球菌2例，肺炎克雷伯菌2例，产气肠杆菌1例，黏质沙雷菌1例，铜绿假单胞菌1例。

2.2. 基本测序信息

采集病例组（12份）和对照组（9份）外周血样本，运用Illumina平台进行高通量测序，从每一个样本获取的测序数据平均值为2 500万次。测序结果显示，与对照组比较，病例组CDR3总序列数、CDR3独有nt序列数、CDR3独有aa序列数均较少，两组比较差异均有统计学意义（ P <0.05）；病例组香农-威纳指数亦低于对照组（ P <0.05）。见表2 。

表2

病例组和对照组CDR3序列相关系数比较（ $\bar{x} \pm s$ ）

组别	例数	CDR3总序列数	CDR3独有nt序列数	CDR3独有aa序列数	香农-威纳指数
对照组	9	1 214 900±417 799	96 679±35 947	85 148±340 055	0.64±0.12
病例组	12	812 703±58 526	28 629±12 836	23 720±1 082	0.50±0.09
t 值		2.867	5.426	5.224	3.064
P 值		0.020	<0.001	0.001	0.006

Open in a separate window

2.3. CDR3序列长度分析

本研究对病例组和对照组的外周血TCR β链CDR3序列长度进行了分析。共获得1 213 665个独特的CDR3 nt序列，为高斯分布，其长度分布在病例组和对照组之间相似，CDR3长度从30~57 nt变化，峰值在42 nt，即14个氨基酸长的片段。

用WebLogo网站分析所有长度为42 nt序列的核苷酸组成，结果显示：病例组和对照组新生儿的CDR3序列V区基因中均是鸟嘌呤（G）利用率相对较高（图1 ）；J区基因中均是胞嘧啶（C）利用率相对较高（图2 ）。

An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is ZGDDEKZZ-23-11-1154-g001.jpg

Open in a separate window

图1

对照组和病例组V区基因碱基系列结构图每一个位点都由ATCG 4个字母组成，每个字母由一种颜色代表，字母的高低代表该碱基的比例大小。横坐标代表基因5'到3'的每一个位点，纵坐标代表某位点几种碱基的比例。对照组（图A）和病例组（图B）均是鸟嘌呤（G）的比例较大。

An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is ZGDDEKZZ-23-11-1154-g002.jpg

Open in a separate window

图2

对照组和病例组J区基因碱基系列结构图每一个位点都由ATCG 4个字母组成，每个字母由一种颜色代表，字母的高低代表该碱基的比例大小。横坐标代表基因5'到3'的每一个位点，纵坐标代表某位点几种碱基的比例。对照组（图A）和病例组（图B）均是胞嘧啶（C）的比例较大。

2.4. 免疫组库多样性分析

比对分析鉴定出系列的VDJ基因后，通过统计重组基因的表达，获得每一种reads的表达数，该表达数从统计学上可以代表一种细胞的相对数量。同时，根据V-J配对的情况，统计每一类V-J配对使用频率的表达情况，并通过3D图（图3 ），直观地看到表达多样性的变化情况：对照组外周血TCR β链CDR3受体库多样性较为丰富，而病例组的CDR3受体多样性较少，呈现寡克隆分布。采用D50作为TCR β链CDR3多样性的评价指标 ^{［

9

］} ，显示病例组TCR β链CDR3序列多样性低于对照组（D50：10.5±0.8 vs 17.3±1.5），差异有统计学意义（ t =13.433， P =0.011）。

An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is ZGDDEKZZ-23-11-1154-g003.jpg

Open in a separate window

图3

对照组和病例组TCR β链CDR3免疫组库3D图 X轴表示V基因亚型，Y轴表示J基因亚型，X-Y平面每一个点代表一个V-J配对的克隆。Z轴则代表每一个克隆的表达丰度。图A为对照组V-J匹配频率热点示例图，其样品的TCR β链CDR3受体库多样性较为丰富；图B为病例组V-J匹配频率热点示例图，其样品的TCR β链CDR3受体库多样性较少。

2.5. 各样本Ｖ和Ｊ区基因片段使用频率分析

对病例组和对照组新生儿外周血TCR β链CDR3免疫组库3D图（图3 ）进行分析显示：48个V区和13个J区基因片段在病例组和对照组之间显示出不同的使用频率，使用Mann-Whitney U 检验得出两组间有意义的基因。全部J区基因片段中，病例组 TRBJ2 - 3 、 TRBJ2 - 5 和 TRBJ2 - 7 的基因使用频率均高于对照组，差异均有统计学意义（ P <0.05），而其他基因在对照组更常见，见表3 。全部V区基因片段中，病例组 TRBV10 - 3 、 TRBV 2和 TRBV20 - 1 的基因使用频率均高于对照组，差异均有统计学意义（ P <0.05），而其他基因在对照组更常见，见表4 。

表3

病例组和对照组J区基因使用频率的比较［中位数（范围）］

基因	对照组( n =9)	病例组( n =12)	TRBJ1-1	0.011(0.007~0.014)	0.009(0.006~0.012)	1.212	0.048
TRBJ1-2	0.016(0.011~0.021)	0.015(0.010~0.020)	1.196	0.047
TRBJ1-3	0.008(0.005~0.010)	0.007(0.004~0.009)	1.011	0.052
TRBJ1-4	0.009(0.006~0.012)	0.008(0.005~0.013)	1.016	0.051
TRBJ1-5	0.012(0.009~0.018)	0.011(0.010~0.018)	1.197	0.047
TRBJ1-6	0.014(0.010~0.018)	0.012(0.008~0.016)	1.198	0.047
TRBJ2-1	0.021(0.013~0.027)	0.019(0.012~0.024)	1.225	0.048
TRBJ2-2	0.020(0.012~0.029)	0.018(0.011~0.025)	1.223	0.048
TRBJ2-3	0.028(0.021~0.032)	0.031(0.021~0.035)	-1.301	0.046
TRBJ2-4	0.008(0.004~0.013)	0.007(0.004~0.012)	1.015	0.051
TRBJ2-5	0.030(0.028~0.037)	0.035(0.031~0.041)	-1.359	0.043
TRBJ2-6	0.007(0.003~0.014)	0.005(0.003~0.011)	1.012	0.052
TRBJ2-7	0.038(0.031~0.087)	0.045(0.040~0.048)	-1.658	0.041

Open in a separate window

表4

病例组和对照组V区基因使用频率的比较［中位数（范围）］

基因	对照组( n =9)	病例组( n =12)	TRBV10-1	0.010(0.008~0.013)	0.009(0.007~0.012)	1.012	0.048
TRBV10-2	0.016(0.012~0.021)	0.015(0.011~0.020)	1.789	0.041
TRBV10-3	0.037(0.035~0.045)	0.047(0.040~0.051)	-2.561	0.031
TRBV11-1	0.012(0.009~0.014)	0.011(0.008~0.014)	1.016	0.047
TRBV11-2	0.015(0.010~0.019)	0.014(0.010~0.018)	1.778	0.042
TRBV11-3	0.013(0.010~0.018)	0.012(0.009~0.016)	1.998	0.040
TRBV12-3	0.019(0.013~0.023)	0.016(0.012~0.021)	2.015	0.038
TRBV12-4	0.022(0.015~0.029)	0.018(0.014~0.025)	2.453	0.032
TRBV12-5	0.014(0.010~0.020)	0.013(0.011~0.021)	1.896	0.039
TRBV13	0.012(0.009~0.014)	0.010(0.008~0.013)	1.055	0.046
TRBV14	0.011(0.008~0.014)	0.010(0.007~0.013)	1.014	0.047
TRBV15	0.011(0.007~0.014)	0.010(0.007~0.014)	1.042	0.045
TRBV16	0.010(0.007~0.013)	0.009(0.006~0.013)	1.055	0.046
TRBV18	0.011(0.006~0.014)	0.010(0.006~0.013)	1.015	0.047
TRBV13	0.012(0.007~0.015)	0.010(0.007~0.013)	1.075	0.043
TRBV2	0.041(0.032~0.048)	0.049(0.041~0.053)	-1.871	0.039
TRBV20-1	0.059(0.054~0.079)	0.089(0.079~0.132)	-3.017	0.023
TRBV24-1	0.027(0.020~0.035)	0.020(0.015~0.025)	2.545	0.031
TRBV25-1	0.017(0.012~0.025)	0.015(0.011~0.027)	1.998	0.035
TRBV27	0.013(0.010~0.019)	0.012(0.010~0.018)	1.017	0.041
TRBV28	0.020(0.014~0.027)	0.017(0.012~0.025)	2.012	0.028
TRBV29	0.025(0.016~0.031)	0.020(0.015~0.027)	2.356	0.022
TRBV30	0.011(0.007~0.014)	0.010(0.006~0.014)	1.041	0.045
TRBV3-1	0.010(0.007~0.013)	0.009(0.006~0.013)	1.038	0.046
TRBV4-1	0.014(0.011~0.019)	0.012(0.010~0.019)	1.058	0.044
TRBV4-2	0.019(0.013~0.027)	0.016(0.013~0.024)	2.012	0.039
TRBV4-3	0.019(0.014~0.029)	0.017(0.013~0.025)	1.998	0.035
TRBV5-1	0.032(0.025~0.037)	0.029(0.020~0.034)	2.457	0.030
TRBV5-4	0.029(0.020~0.035)	0.027(0.020~0.033)	2.014	0.037
TRBV5-5	0.012(0.008~0.015)	0.010(0.006~0.013)	1.075	0.044
TRBV5-6	0.013(0.010~0.020)	0.012(0.010~0.018)	1.073	0.043
TRBV5-8	0.010(0.006~0.013)	0.009(0.007~0.012)	1.015	0.048
TRBV6-1	0.014(0.009~0.020)	0.013(0.011~0.019)	1.996	0.039
TRBV6-2	0.011(0.007~0.014)	0.010(0.006~0.014)	1.043	0.045
TRBV6-3	0.010(0.008~0.015)	0.009(0.007~0.012)	1.013	0.048
TRBV6-4	0.012(0.008~0.015)	0.011(0.007~0.014)	1.038	0.047
TRBV6-5	0.029(0.020~0.035)	0.025(0.018~0.033)	2.256	0.032
TRBV6-6	0.014(0.010~0.019)	0.012(0.010~0.019)	1.057	0.044
TRBV6-8	0.009(0.007~0.012)	0.008(0.006~0.012)	1.010	0.049
TRBV6-9	0.012(0.008~0.015)	0.011(0.007~0.013)	1.039	0.047
TRBV7-2	0.032(0.025~0.038)	0.028(0.020~0.032)	2.467	0.029
TRBV7-3	0.028(0.020~0.033)	0.025(0.018~0.031)	2.253	0.033
TRBV7-4	0.009(0.007~0.012)	0.008(0.006~0.012)	1.009	0.050
TRBV7-6	0.014(0.010~0.020)	0.012(0.009~0.019)	1.056	0.045
TRBV7-7	0.010(0.008~0.015)	0.009(0.007~0.012)	1.038	0.047
TRBV7-8	0.013(0.010~0.021)	0.012(0.010~0.018)	1.997	0.039
TRBV7-9	0.029(0.021~0.034)	0.025(0.018~0.030)	2.271	0.032
TRBV9	0.014(0.010~0.021)	0.012(0.010~0.019)	1.068	0.043

Open in a separate window

3. 讨论

新生儿脓毒症是新生儿期感染致死的主要原因，若识别和救治不及时可迅速导致多器官功能障碍 ^{［

1

］} 。最新证据表明免疫反应在脓毒症的发病过程中起到重要作用 ^{［

10

］} 。新生儿对病原体的易感性，不仅因免疫系统不成熟所致，近年来越来越多的研究表明，适应性免疫在新生儿抗感染免疫中具有关键作用 ^{［

11

］} 。T细胞和B细胞是适应性免疫的两种主要细胞组分，其中Ｔ细胞是机体细胞免疫功能的执行者。TCR既是T细胞特异性识别和结合特异性抗原表位触发免疫应答的关键分子，其中TCR高变区的CDR3变异最大，是最能代表T细胞的应答特征，其在外周形成了具有多样性的T细胞CDR3受体库 ^{［

12

］} 。TCR多样性是保证个体在多变环境中对不同外来抗原发生有效免疫应答的关键，但对于其在抗感染免疫中的作用及其机制尚不清楚。因此，本研究利用免疫组库测序技术分析新生儿脓毒症患者外周血TCR多样性对其发病的免疫应答机制显得非常重要。

本研究通过采集病例组和对照组新生儿外周血样本，运用Illumina HiSeq 2000平台进行高通量测序，从每一个样本获取的测序数据平均值为2 500万次，远大于既往报道的100万次 ^{［

13

］} ，因此，可认为本研究测序的结果是稳定和可信的。测序结果显示：与对照组比较，病例组患儿CDR3总序列数、CDR3独有nt序列数、CDR3独有aa序列数都相对较少，两组比较差异均有统计学意义，提示在抗原的刺激下可以引起具有特定的CDR3区T细胞扩增。

本研究运用免疫组库测序技术共获得1 213 665个独特的CDR3nt序列，病例组CDR3长度与对照组比较差别不大，都呈高斯分布；用WebLogo网站分析所有长度为42 nt序列的核苷酸组成，病例组和对照组的CDR3序列V区基因中均是鸟嘌呤（G）利用率相对较高，J区基因中均是胞嘧啶（C）利用率相对较高，研究结果显示病例组和对照组新生儿CDR3的长度和类型相似，与文献报道一致，提示免疫组库建库成功 ^{［

13

］} 。本研究采用D50和香农-威纳指数作为TCR β链CDR3多样性的评价指标，显示病例组TCR β链CDR3序列多样性低于对照组。江意春等 ^{［

14

］} 采用高通量测序分析成人脓毒症患者早期T细胞TCR β链CDR3的多样性，显示明显降低。本研究在初步建立TCR受体库的基础上采用多种方法评估脓毒症新生儿外周血TCR β链CDR3多样性，研究结果均显示脓毒症新生儿外周血TCR β链CDR3多样性下降，提示脓毒症新生儿T细胞亚群减少或消失，对抗原的应答能力下降。其机制可能是在严重感染状态下，特殊的抗原刺激可引起某一或某些亚家族的TCR特异性重排，出现某些TCR特异性的T细胞克隆性增殖的现象，破坏TCR多样性。

本研究对病例组和对照组新生儿外周血TCR β链CDR3免疫组库3D图进行了分析。对V片段48个基因的使用频率进行比较显示，其中 TRBV10 - 3、TRBV2 和 TRBV20 - 1 的使用频率病例组均高于对照组，差异有统计学意义；J片段13个基因的使用频率进行比较，其中 TRBJ2 - 3、TRBJ2 -5和 TRBJ2 - 7 的使用频率病例组高于对照组，差异有统计学意义。既往研究已明确用测定特定CDR3顺序出现的频率，来观察特定T细胞克隆增加的程度，并能反映T细胞的功能状态 ^{［

15

］} 。因此，本研究结果提示新生儿脓毒症患儿外周血TCR β链CDR3序列的 TRBV20 - 1、TRBV2、TRBV10 - 3、TRBJ2 - 7、TRBJ2 - 5 和 TRBJ2 - 3 可能参与疾病的免疫应答，为以后进一步研究新生儿脓毒症发病机制提供了依据。

综上所述，本研究显示脓毒症新生儿TCR β链CDR3多样性降低，推测V、J区部分亚型的异常表达可能参与新生儿脓毒症的免疫应答，患儿基础免疫状态的复杂性可能是免疫功能失调导致脓毒血症的原因之一。下一步的研究有待扩大样本量，对不同类型细菌感染致脓毒症新生儿TCR β链CDR3多样性及与预后的关系进一步研究；分析整个病程各阶段的T细胞功能，在免疫组库的基础上筛选出新生儿脓毒症患者外周血TCR β链的优势取用CDR3序列，探寻这些包含特定CDR3序列的TCR所针对的抗原特征，期待在揭示新生儿脓毒症免疫应答机制的基础上为其特异性T细胞免疫治疗提供依据。

基金资助

深圳市龙岗区科技创新局项目（LGKCYLWS2020009）。

参考文献

1. Fleischmann-Struzek C, Goldfarb DM, Schlattmann P, et al.. The global burden of paediatric and neonatal sepsis: a systematic review [J]. Lancet Respir Med , 2018, 6 ( 3 ): 223-230. PMID: . DOI: 10.1016/S2213-2600(18)30063-8. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

2. Shane AL, Sánchez PJ, Stoll BJ. Neonatal sepsis [J]. Lancet , 2017, 390 ( 10104 ): 1770-1780. PMID: . DOI: 10.1016/S0140-6736(17)31002-4. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

3. Schüller SS, Kramer BW, Villamor E, et al.. Immunomodulation to prevent or treat neonatal sepsis: past, present, and future [J]. Front Pediatr , 2018, 6 : 199. PMID: . PMCID: . DOI: 10.3389/fped.2018.00199. [ PMC free article ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

4. Timperi E, Folgori L, Amodio D, et al.. Expansion of activated regulatory T cells inversely correlates with clinical severity in septic neonates [J]. J Allergy Clin Immunol , 2016, 137 ( 5 ): 1617-1620.e6. PMID: . DOI: 10.1016/j.jaci.2015.10.048. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

5. Winterberg PD, Robertson JM, Kelleman MS, et al.. T cells play a causal role in diastolic dysfunction during uremic cardiomyopathy [J]. J Am Soc Nephrol , 2019, 30 ( 3 ): 407-420. PMID: . PMCID: . DOI: 10.1681/ASN.2017101138. [ PMC free article ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

6. Venet F, Filipe-Santos O, Lepape A, et al.. Decreased T-cell repertoire diversity in sepsis: a preliminary study [J]. Crit Care Med , 2013, 41 ( 1 ): 111-119. PMID: . DOI: 10.1097/CCM.0b013e3182657948. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

7. 中华医学会儿科学分会新生儿学组, 中国医师协会新生儿科医师分会感染专业委员会 . 新生儿败血症诊断及治疗专家共识(2019年版) [J]. 中华儿科杂志 , 2019, 57 ( 4 ): 252-257. PMID: . DOI: 10.3760/cma.j.issn.0578-1310.2019.04.005. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

8. Keylock CJ. Simpson diversity and the Shannon-Wiener index as special cases of a generalized entropy [J]. Oikos , 2005, 109 ( 1 ): 203-207. DOI: 10.1111/j.0030-1299.2005.13735.x. [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

9. 鲍俊杰, 徐启桓, 邹勇, 等. 高通量测序分析原发性胆汁性肝硬化患者外周血CD4 ⁺ T细胞受体Vβ链CDR3免疫组库 [J]. 中华肝脏病杂志 , 2015, 23 ( 8 ): 580-585. PMID: . DOI: 10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2015.08.005. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

10. Monneret G, Venet F. Sepsis-induced immune alterations monitoring by flow cytometry as a promising tool for individualized therapy [J]. Cytometry B Clin Cytom , 2016, 90 ( 4 ): 376-386. PMID: . DOI: 10.1002/cyto.b.21270. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

11. Ghazal P, Dickinson P, Smith CL. Early life response to infection [J]. Curr Opin Infect Dis , 2013, 26 ( 3 ): 213-218. PMID: . DOI: 10.1097/QCO.0b013e32835fb8bf. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

12. 杨桂淇, 薛雯, 戴勇. T细胞抗原受体β链互补决定区3受体库高通量测序分析及其在重要疾病中的研究应用 [J]. 国际免疫学杂志 , 2016, 39 ( 5 ): 522-526. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-4394.2016.05.024. [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

13. Sun J, Sun B, Gao Y, et al.. Composition and variation analysis of the T cell receptor β-chain complementarity determining region 3 repertoire in neonatal sepsis [J]. Scand J Immunol , 2017, 86 ( 5 ): 418-423. PMID: . DOI: 10.1111/sji.12614. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

14. 江意春, 袁丰华, 赵颖, 等. 高通量测序分析脓毒症患者早期T细胞抗原受体β链CDR3的组成及多态性 [J]. 中国急救医学 , 2018, 38 ( 11 ): 976-981. DOI: 10.3969/j.issn.1002-1949.2018.11.011. [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

15. Fozza C, Barraqueddu F, Corda G, et al.. Study of the T-cell receptor repertoire by CDR3 spectratyping [J]. J Immunol Methods , 2017, 440 : 1-11. PMID: . DOI: 10.1016/j.jim.2016.11.001. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

Articles from Chinese Journal of Contemporary Pediatrics are provided here courtesy of Xiangya Hospital, Central South University

免疫组库测序分析新生儿脓毒症患者外周血T细胞受体β链CDR3的多样性

Diversity of the T cell receptor β chain complementarity-determining region 3 in peripheral blood of neonates with sepsis: an analysis based on immune repertoire sequencing

黄 循斌

叶 淑珍

邬 吉伟

符 青松

刘 碧华

丘 惠娴

程 国强

2. 结果

2.1. 一般情况

表1

2.2. 基本测序信息

表2

2.3. CDR3序列长度分析

2.4. 免疫组库多样性分析

2.5. 各样本Ｖ和Ｊ区基因片段使用频率分析

表3

表4

3. 讨论

基金资助

参 考 文 献

黄循斌

叶淑珍

邬吉伟

符青松

刘碧华

丘惠娴

程国强

参考文献