1 型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是一种全球流行性的慢性自身免疫疾病，对人类健康危害极大 ^{[ 1 - 3 ]} 。外源性胰岛素输注是目前临床治疗 T1DM 的标准疗法，但其仍达不到理想的血糖控制，低血糖的发生和微血管病变进展的风险仍然存在。旨在重建内源性胰岛素分泌系统的 β 细胞替代治疗，因具有维持葡萄糖自稳态的优势，而逐渐成为关注与研究的热点 ^{[ 4 - 7 ]} 。目前，临床可用的 β 细胞替代治疗为胰腺移植（pancreas transplantation，PT）和胰岛移植（pancreatic islet transplantation，PIT） ^{[ 8 - 10 ]} 。自 2000 年加拿大 Edmontion 方案取得成功后 ^{[ 11 ]} ，随着免疫调节与细胞制备等技术的改进，PIT 后的血糖控制与长期（3 年、5 年）脱离胰岛素的比例现已基本接近 PT ^{[ 12 - 16 ]} 。与 PT 相比，PIT 具有手术风险低、操作简便、可体外修饰移植物及多次输注等优点，是一种极具前景的糖尿病治疗方法 ^{[ 5 , 13 , 15 , 17 - 18 ]} 。然而，和器官移植一样，PIT 面临的首要挑战是供体的缺乏 ^{[ 19 ]} ，提供充足、合适的供胰来源，是临床广泛开展 PIT 治疗 T1DM 的前提。现就 PIT 的供体细胞来源作一综述。

1. 同种（人类）来源胰岛细胞

2. 异种来源胰岛细胞

异种 PIT 被认为是解决临床供胰缺乏的一种具有前景的替代策略。猪因具有以下诸多优点而被认为是最佳的异种胰岛供体，如胰岛素结构与人类相似、来源充足、易于基因改造、抗自身免疫破坏及较少的伦理问题等 ^{[ 51 ]} 。相对于性别、体质量等因素而言，年龄是影响猪胰岛产量、大小及功能更为重要的因素 ^{[ 52 - 53 ]} 。胎猪由于胰腺组织体积较小、分化未完全，仅能分离出少量的未成熟胰岛细胞，通常需要大量供体以提供充足的移植细胞，以及植入后较长时间（2 ~ 3 个月）以便细胞成熟而发挥降糖功效；这些均不利于临床前期研究与临床大规模应用，还会带来动物伦理问题 ^{[ 51 , 54 ]} 。通常，>24 月龄的成年猪被视为适宜的异种胰岛供体，因其可提供较为充足的具有完整形态、大尺寸（直径 150 ~ 200 μm）、结构良好的功能性胰岛细胞 ^{[ 55 - 56 ]} 。与成年猪胰岛相比，新生猪胰岛细胞簇（neonatal pig pancreatic cell clusters，NPCCs）具有更为独特的优势：良好的缺血/炎性损伤抗性、易于分离纯化、低 T 细胞反应性等 ^{[ 57 ]} 。NPCCs 有望成为异种胰岛另一更有前景的来源。有研究表明 ^{[ 53 , 58 - 59 ]} ，<5 日龄新生猪来源的 NPCCs 一般具有较好的活性与功能。目前，由新西兰 Living Cell Technology 公司研发的胶囊包被 NPCCs 产品“Diabecell”，已进入后期临床测试阶段，并阶段性地取得了良好疗效。

其次，为有效地降低猪-人移植中人畜共患病的感染几率，应尽量选择无特定病原体的猪群。国外的无特定病原体芝加哥小型猪、新西兰奥克兰岛猪及国内培育的封闭系五指山小型猪、“XENO-1”小型猪等，均是较为实用的异种供体 ^{[ 52 ]} 。随着基因工程技术的发展，以转基因猪作为异种胰岛供体显示出更为广阔的应用前景，可有效减少早期移植物丢失、保护植入胰岛免受免疫反应攻击并促进其长期定植 ^{[ 60 - 61 ]} 。同时，多基因改造目前尚未显示对胰岛功能本身具有不良影响 ^{[ 62 - 63 ]} 。随着 CRISPR/Cas9 等新型、高效基因编辑技术的出现，更大的异种 PIT 进展或将在转基因猪中取得。

尽管目前猪胰岛异种移植已逐渐接近临床应用，但仍存在一些问题：① 缺乏安全、有效的可实现胰岛长期功能性定植的免疫抑制措施。随着胶囊包被、共刺激通路阻断等技术的发展与完善，或可达到长期、稳定的移植物免疫保护。② 即刻经血液介导的炎性反应（instant blood-mediated inflammatory reaction，IBMIR）的产生仍是早期胰岛丢失或失去功能的主要原因。多基因修饰猪（敲除组织因子并过表达凝血调节因子） ^{[ 64 - 65 ]} 联合胰岛保形包被技术 ^{[ 66 ]} 或可有效地抑制 IBMIR 的发生。③ 如何更为经济地获取大量且高质量的功能性猪胰岛。应尽快确立简便、经济及标准化的猪胰岛移植物制备与鉴定标准。④ 生物安全性。存在猪内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）感染人类的风险。虽然目前在已报道的猪-人 PIT 试验中，尚未发现 PERV 感染现象，但其风险性不容忽视。在开展猪 PIT 前，有必要对可能出现的微生物感染（如 PERV、猪巨细胞病毒及圆环病毒等）进行安全筛查与评估。将来利用更为成熟的基因编辑技术 ^{[ 67 ]} ，或可彻底消除生物安全风险。

此外，罗非鱼、牛、犬类及灵长类等也可作为异种 PIT 的供体来源，但目前未取得较佳的移植疗效。

3. 干细胞源性胰岛样细胞

为缓解死亡捐献供胰所面临的胰岛来源匮乏，研究者们已开始将注意力集中于从干细胞诱导产生功能性胰岛 β 细胞或内分泌细胞群。目前，有多种类型的干细胞，至少在体外，可分化为针对葡萄糖刺激产生胰岛素分泌反应的 β 样细胞，如胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs） ^{[ 68 ]} 、诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs） ^{[ 69 ]} 、MSCs ^{[ 70 - 71 ]} 、成体组织来源干细胞（肝干细胞、胰腺成体干细胞等） ^{[ 72 ]} 及直接重新编辑体细胞 ^{[ 73 - 74 ]} 等。其中，多能干细胞与重新编辑体细胞（即转分化）为研究关注较多的领域 ^{[ 75 ]} 。

ESCs 拥有发育的全能性。已有研究证实鼠源性与人源性 ESCs 可分化为产胰岛素细胞（insulin-producing cells，IPCs）。D’Amour 等 ^{[ 68 ]} 在体外模拟胰腺的发育，首次利用五步分化法诱导人 ESCs 经过一系列内胚层中间体分化为具有胰岛素、胰高血糖素等激素分泌能力的 IPCs；但分化细胞针对葡萄糖刺激的 C 肽释放量极其微弱。后续研究进一步表明 ^{[ 76 ]} ，ESCs 来源的 IPCs 在糖尿病小鼠体内可分化为成熟的功能性 β 细胞并能改善受体糖代谢。目前，一项由美国 Viacyte 生物技术公司开展的胶囊包被 ESCs 来源胰腺内胚层细胞（ViaCyte VC-01）移植治疗 T1DM 的前瞻性临床试验（Ⅰ/Ⅱ期，注册号： {"type":"clinical-trial","attrs":{"text":"NCT02239354","term_id":"NCT02239354"}} NCT02239354 ）正在招募进行中。然而，ESCs 定向诱导分化 IPCs 策略仍存在特有问题：异体来源细胞的免疫排斥反应与伦理道德限制。iPSCs、MSCs 及成体组织干细胞则可来源于 T1DM 患者本身，几乎无移植后免疫排斥风险且不受伦理约束，是潜在的胰岛细胞来源。事实上，iPSCs 常被认为是自体来源的 ESCs。多个研究小组证实 ^{[ 69 , 77 ]} iPSCs 与 ESCs 均可通过相同的诱导方案分化成为 IPCs，且分化效能相似；体内实验亦表明植入 iPSCs 来源的 IPCs 可使糖尿病小鼠血糖恢复至正常水平 ^{[ 78 - 79 ]} 。需要说明的是，iPSCs 来源的细胞在自体内仍具有一定免疫原性 ^{[ 80 ]} ，其可能原因是由基因操作本身所致（如反转录病毒载体整合）。目前，借助于非整合载体、重复 mRNA 转染及转座子切除等基因编辑技术，可获得无载体/转基因的 iPSCs 细胞株，从而大大降低其在临床转化应用过程中存在的安全风险及免疫原性。

由 iPSCs 技术衍生出的另一种重要研究潮流，是将一种体细胞“直接重编程”为另一种终末分化体细胞，此转分化过程中无需经历干细胞中间状态。研究者们利用转录因子（transcription factor，TF）的组合来实现体细胞的直接转分化。通过转导入 TF 组合（Pdx1+Ngn3+Mafa）可成功使成体小鼠胰腺外分泌细胞 ^{[ 81 ]} 、肝细胞 ^{[ 74 ]} 及食蟹猴胆管上皮细胞 ^{[ 82 ]} 分别转分化为 IPCs。此外，转导入 Ngn3、Ngn3+Mafa 可分别使胰腺腺泡细胞（外分泌细胞）直接转分化为胰岛 δ 样、α 样细胞 ^{[ 83 ]} 。基于不同的 TF 组合，可诱导腺泡细胞直接转分化而形成较完整的胰岛细胞单元，为重建 T1DM 患者内源性胰岛素分泌调节系统及扩大移植细胞来源奠定了实验基础。此外，成体胰腺的导管组织中含有胰腺前体细胞，已证实具有多向分化潜能，在适宜的刺激诱导条件下可分化为 IPCs。基于此，传统胰岛制备过程中视为废弃物的组织细胞（如外分泌腺、导管组织等）似乎重新具备可利用价值 ^{[ 84 ]} ；有必要进一步改良目前的分离制备技术与流程，以提高胰腺组织的利用率。然而，直接重编辑技术临床应用前仍需解决一些难题：转分化效率、稳定性及靶细胞功能欠佳，合适 TF 的确认与选择，存在表观遗传记忆，及基因操作本身所来的免疫排斥风险。

MSCs 除拥有分化潜力大、增殖能力强等干细胞基本特征外，还具备免疫原性低、免疫调节及重建、易于取材分离、便于商业化制备等自身优势。已有较多研究证实 MSCs 体外可直接诱导分化为 IPCs，体内植入糖尿病动物后可维持其糖代谢于正常范围 ^{[ 75 ]} 。近年 Thakkar 等 ^{[ 85 ]} 与 Cai 等 ^{[ 86 ]} 研究表明，MSCs 来源 IPCs 或 MSCs+骨髓干细胞共输注可使 T1DM 患者达到良好的长期（1 年）血糖控制。而对于 2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者，MSCs 输注可显著改善患者的胰岛功能，部分患者可达到长期（>24 个月）的脱离胰岛素 ^{[ 87 ]} 。Pan 等 ^{[ 88 ]} 近期研究则显示，MSCs 在 T2DM 树鼩体内可直接分化为 IPCs 并发挥良好的降糖效果。以上研究均提示 MSCs 有望成为移植治疗糖尿病的细胞来源。然而，目前缺乏成熟的 MSCs 分化为功能性 β 细胞的诱导方案，且 MSCs 治疗糖尿病的机制尚不完全明确；仍需更多、更深入的实验及前期临床研究，为其安全、有效的临床应用奠定基础。

目前，干细胞来源 PIT 所面临的普遍性问题有 ^{[ 89 ]} ：① 缺乏明确的干细胞表面标记，干细胞分离、鉴定困难；② 诱导/转分化成功率及效率较低；③ 获取的 IPCs 胰岛素分泌效能较弱，细胞增殖能力有限，难以大规模商业化生产，且体内植入后远期效果不稳定；④ 遗传错误、变异及成瘤风险，临床安全性有待更全面、深入的评估；⑤ 受体自身免疫系统对 IPCs 的破坏。因此，干细胞来源 PIT 治疗糖尿病离实际临床应用仍有较长距离，需要深入研究干细胞分化机制，优化并标准化干细胞制备方法，不断探索并改良诱导分化条件，规范移植方法与技术，优化免疫抑制策略（如联合免疫包被、共刺激通路阻断等技术）。

4. 胰岛细胞株

尽管胰岛 β 细胞具有一定生长能力，但目前尚无可行的体外扩增 β 细胞方法。建立可植入的“永生化”β 细胞系或可彻底解决胰岛来源匮乏的难题。目前，国内外研究者已成功建立基于胰岛素瘤衍生而来的多种属 β 细胞系，如 NIT-1（鼠源）、INS-1 （鼠源）、RIN-m5F（鼠源）、Beta-TC-6（鼠源）、EndoC-βH1（人源）、EndoC-βH2（人源） ^{[ 90 - 94 ]} ，是进行 β 细胞相关研究较为理想的替代品。这些细胞既有强大的增殖潜能，又具备正常 β 细胞的一些重要功能特征，如特异性表型分子表达、胰岛素产生与分泌、葡萄糖刺激反应性等，部分细胞系还具有较好的动物模型体内降糖作用。然而，胰岛细胞的结构与功能复杂，血糖水平受多种激素精确调控，现有细胞杂交融合或基因重组技术尚不能生产出近乎正常的胰岛 β 细胞。胰岛细胞株移植离大规模动物及临床前期试验仍有较长的距离。此领域的突破或将依赖于对细胞生长发育及基因工程等学科的深入研究。

5. 展望

近年来随着胰岛分离制备及移植技术的日趋成熟，临床 PIT 取得不少成就。然而，即使现有的捐赠供胰均能成功地进行“一对一”PIT，胰岛的数量仍远不能满足糖尿病患者的需求。因此，寻求异种及由分化或转分化而来的替代胰岛来源具有十分重要的意义。随着社会捐赠意识的普及与体系的完善，胰岛分离及保存、免疫耐受诱导、基因工程、干细胞制备与诱导分化等技术的发展，以及对胰岛发生、分化、凋亡等调控机制的深入了解，未来可供移植胰岛的来源将会大大丰富，有望推动细胞替代治疗成为 T1DM 治疗的标准方法之一。

志谢： 西安交通大学医学院靖宁女士对本文文字编辑做出的重要贡献

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（30700772）

National Natural Science Foundation of China (30700772)

References