【摘要】： 人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是世界公认的最普遍的引起性传播疾病的病原,与多种恶性肿瘤的发生有密切关联,95%的宫颈癌都是HPV感染导致的。研究发现,HPV感染导致肿瘤发生,主要是由于其E6、E7基因整合到宿主细胞基因组,其表达的蛋白与肿瘤细胞的生长具有重要影响。因此E6和E7成为HPV相关肿瘤免疫治疗领域中广泛关注的重要抗原。近年来,通过靶向E6和E7并杀伤表达E6/E7肿瘤细胞的T细胞免疫疗法,已经成为治疗HPV相关肿瘤的重要研究方向。HLA-A11是中国人群频率较高的HLA-A位点多态性基因,然而目前尚未鉴定出HPV特异性的HLA-A11限制性T细胞表位,为HPV相关肿瘤的免疫治疗带来了一定局限性。本论文主要的主要研究内容在于鉴定HPV E6/E7抗原HLA-A11限制性T细胞表位及T细胞受体(TCR),为HPV相关肿瘤的免疫治疗提供基础。研究筛选鉴定了HLA-A11限制性的E6、E7抗原的T细胞表位,筛选出了相关抗原表位的特异性T细胞受体(TCR)。取得的主要结果包括:(1)生物信息学预测HLA-A11限制性E6、E7表位:利用表位数据库网站IEDB(www.iedb.org),预测出10条HLA-A11限制性多肽。其中,E6有9条,E7有1条。(2)表位鉴定及特异性T细胞检测:合成预测的10条多肽,将合成的多肽混合,随后和CTL免疫佐剂混合注射到HLA-A11转基因小鼠腹部皮下,每周一次,共三次,第四周取样。采用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)技术,鉴定出2条E6多肽具有阳性反应,分别是HPV-E6-A11-08和HPV-E6-A11-09。一条E7多肽呈阳性,HPV-E7-A11-01。(3)特异性T细胞分选及单细胞测序:根据ELISPOT的结果,将三条阳性多肽分别与HLA-A11/β2m包涵体进行体外复性。结果显示,这三条多肽都能与HLA-A11/β2m体外形成MHC复合物。将MHC复合物蛋白制成tetramer,用于流式分选表位特异性T细胞。分选结果显示,HPV-E6-A11-09多肽制成的tetramer分选出明显阳性细胞群,另外两条肽无明显阳性细胞群。通过单细胞测序技术,测出每个单细胞的TCR序列。根据序列频率,从2只小鼠的淋巴细胞中筛选出4个鼠源TCR序列。(4)TCR表达载体构建及流式鉴定:单细胞测序得到的TCR序列,分析得到每个TCR序列的α链和β链的V区,分别将鼠源α链和β链的V区和人源TCRα链和β链的C区构建到一起,形成一个新的TCR的α链和β链,α链和β链以一段linker连接。随后将改造的TCR构建到p CDH＿EF1＿MCS＿T2A＿puro载体上。将构建好的4个TCR表达载体分别和CD3/CD8质粒共转染到293T细胞。使用HPV-E6-A11-09多肽制成的tetramer流式鉴定。结果显示,构建的4个TCR都能在293T细胞上表达,并与E6-9-tetramer特异性结合。总之,本研究初步鉴定出了HPV E6和E7抗原特异性的HLA-A11限制性T细胞表位,并通过转基因小鼠免疫,筛选获得了表位特异性TCR。进一步将通过功能实验对这些TCR对靶细胞的细胞因子反应能力及肿瘤抑制活性进行评价。这些研究和发现为HPV相关肿瘤的免疫治疗提供了重要基础。 孙斌;李雯;计云霞;郭向华;杨晓珍;郝美君;李伟华;白飞云;王延军;郑加生;陈德喜;; GPC3特异性HLA-A11限制的T淋巴细胞表位肽免疫活性检测 [J];北京医学;2014年09期 王培东;何俊才;周放;张露;郑辉;刘(王亭);余晓丽;; 分枝杆菌Rv2450c T细胞表位预测及分析 [J];武汉轻工大学学报;2019年01期 程华;成彬;羊红光;; 线性B细胞表位预测方法研究进展 [J];中国免疫学杂志;2017年09期 练瑶;黄泽炽;葛猛;; 基于深度最大输出网络的抗体种型特异性B细胞表位预测（英文） [J];激光生物学报;2016年01期 李晓燕;孔梅;郭丽茹;杨东靖;苏旭;刘英华;邹明;吕莉琨;; 人偏肺病毒多表位抗原的构建与表达 [J];环境与健康杂志;2015年11期 刘洪波;; 线性B细胞表位预测的生物信息学资源和工具的研究进展 [J];中国生物制品学杂志;2016年06期 刘波;张春华;; 基于支持向量机构象性B细胞表位预测研究 [J];吉林大学学报(信息科学版);2015年03期 董娇娇;刘子钰;刘春宇;张友;; 线性B细胞表位预测应用研究 [J];计算机光盘软件与应用;2013年24期 蒋春英;魏建超;史子学;钟登科;邵东华;李蓓蓓;马志永;; 展示日本乙型脑炎病毒B细胞表位和T细胞表位的猪细小病毒病毒样颗粒的制备 [J];中国兽医科学;2013年04期 赵德;乔翠;张强;郭建宏;高凤山;; 表位疫苗研究进展 [J];动物医学进展;2012年01期 李玉娇;朱玥洁;杨晶;丁剑冰;; 抗原优势表位的筛选方法 [J];中国病原生物学杂志;2012年01期 周珠哈;王安;吴乐;朱珊丽;朱冠保;张丽芳;; 人类表皮生长因子受体2的B细胞表位初步预测分析 [J];中国全科医学;2010年05期 赵鑫;王宏;向军俭;朱中松;宋其芳;邓宁;; 血管内皮细胞生长因子表位肽体外抗肿瘤作用研究 [J];中国免疫学杂志;2010年05期 周游;王清明;; B细胞表位的计算机预测 [J];生命的化学;2008年06期 刘凯军;李晋涛;; 细胞毒性T淋巴细胞表位预测 [J];生命的化学;2008年03期 章辉;朱荫昌;; B细胞表位预测的研究进展 [J];中国血吸虫病防治杂志;2006年03期 周洪; T细胞表位的确定 [J];细胞生物学杂志;2002年04期 丁健,何非,陆韵,肖翌,陈应华; 多表位-表位疫苗诱导多中和表位特异性的抗HIV-1抗体 [J];科学通报;2001年17期 刘冯欢;张菁;王欢;左斌;李婉宜;王保宁;李明远;李燕;; 甲型流感病毒核蛋白的表达与鉴定及其B细胞表位的预测 [A];第二届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学三江论坛论文汇编[C];2011年 马宏伟;卢煜东;李钟;陈启军;; 叠瓦式二级筛选方法及其在大规模表位筛选中的应用 [A];第九届全国免疫学学术大会论文集[C];2014年 王充;李柏青;; 结核分枝杆菌抗原B细胞表位肽对人外周γδ T细胞的特异性激活作用 [A];第九届全国免疫学学术大会论文集[C];2014年 金明兰;南文龙;韩松;朱占波;金宁一;; 抗原表位及多表位疫苗研究进展 [A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集（上册）[C];2009年 金洪涛;金宁一;李臻;; 表位及多表位疫苗的研究进展 [A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会论文集[C];2005年 周晓红;陈晓光;张晓东;杨培梁;王亚楠;李林;习佳飞;胡建军;; 弓形虫多表位基因植物表达载体的构建 [A];中国动物学会第七届全国青年寄生虫学工作者学术讨论会论文摘要集[C];2002年 马樱;唐康;张宇丝;张春梅;张赟;金伯泉;; 汉滩病毒结构蛋白串联抗原表位的分子设计及免疫原性评价 [A];第十二届全国免疫学学术大会摘要汇编[C];2017年 王梦瑶;余崴;于立权;于永忠;王丽姿;崔玉东;; 金黄色葡萄球菌GapC蛋白B细胞表位的鉴定 [A];第十二届全国免疫学学术大会摘要汇编[C];2017年 刘苏东;董海平;王娟娟;温茜;何健淳;杨晓帆;马骊;; HLA-A*11:01限制性结核分枝杆菌CD8+T细胞表位的筛选与鉴定 [A];第十届全国免疫学学术大会汇编[C];2015年 陈雷;隋传宇;陈虹;邵东华;杨健美;苑纯秀;冯新港;林矫矫;; 日本血吸虫分泌型和跨膜蛋白分子T辅助细胞表位的预测与鉴定 [A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会论文集[C];2009年 何玲;陈瑞爱;裴仉福;罗满林;; 多表位基因工程疫苗的研究及应用效果 [A];中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2010年学术年会（第三届中国兽药大会学术论坛）论文集[C];2010年 宋哲;刘涛;刘伟;; 基于氨基酸残基结构描述符预测T细胞表位 [A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年 蒋天舒;娄加陶;吴传勇;周晔;陈波;陈燕;谷明莉;邓安梅;; 利用原核表达系统发酵制备重组结核抗原多表位肽 [A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年 刘雨辉;王延江;; Aβ自身抗体表位相关的功能异质性 [A];第四届全国痴呆与认知障碍学术研讨会及高级讲授班论文汇编[C];2015年