《天然药物化学实验 课程 》 是 中药学 专业本科生教学的 专业 必修课程，实验的基本内容是根据各类化合物的主要理化性质，选择合适的提取、分离、精制的方法，将原药材中的有效成分提出，并选用适当的鉴定方法，对提取物作出鉴别。实验的目的是培养学生的基本操作技能，并通过实验现象加深对理论学习中一些问题的理解和思考。教学大纲要求实验学时 36 学时。实验类别为操作性实验、验证性实验。 提取分离 实验为 4 个 实验，每个实验计划 9-10 小时 。

考核方式： 实验预习 20% 、实验 课 操作 40% 、实验报告 40% 。

实验教材： 自编教材 ：王翠玲等，《天然药物化学实验指导》

操作性实验，融入到验证性实验中，便于学生掌握、应用基本操作，达到学以致用，提高教学质量。

实验守则及要求

1. 天然药物化学实验室要求

天然药物化学实验教学的目的是让同学在认识、掌握天然产物提取、分离机纯化等基本理论知识的基础上了解、熟悉相应的实验方法及操作，训练其天然产物提取分离的基本操作技能，培养他们仔细观察实验现象的习惯，加深对理论知识的理解。天然药物化学实验教学让同学们学会分析实验数据和结果，总结实验结论的方法，通过反复的理论和实验学习，达到对天然药物基本知识的深刻理解。

为了提高天然药物化学实验课的效果，要求同学实验前认真预习实验内容，了解实验的目的、原理；实验中严格操作规程，仔细观察实验现象，尊重事实，及时地、简明扼要地、字迹清楚地记录各种观察的结果及数据，养成良好的实验习惯；实验结束后认真处理数据，从理论高度总结实验中观察到的现象和得到的结果，及时完成实验报告。

2. 天然药物化学实验室规则

为了保证实验的正常进行和培养良好的实验作风，学生必须遵守下列实验室规则。

(1) 实验的全过程应听从指导教师的指导。

(2) 实验前做好准备工作，应先熟悉所需试试剂的放置位置，并检查仪器是否完好无损，及时调换破损和故障的仪器。

(3) 实验中应保持安静，并遵守秩序。实验进行时，严格按操作规程和实验步骤进行实验，操作要认真仔细，思想要集中，不得擅自离开实验室。合理安排实验的全过程，按时结束相关操作。

(4) 注意安全，发生意外事故应及时采取应急措施，并立即报告指导老师。

(5) 爱护仪器，注意节约水、电、煤气及消耗性药品。公用试剂、仪器用完后立即恢复待用状态，并归还原处。

(6) 保持实验室的整洁。实验时做到桌面、地面、水槽、仪器四净，实验时产生的固体垃圾应投入废物缸中，不得丢入水槽。实验完毕应立即清洗仪器，整理桌面，关闭所用水、电、煤气。

(7) 轮流值日。值日生的职责为整理公用仪器，打扫实验室，清倒废物缸，并协助实验室管理人员检查和关好水、电、煤气和门窗。

3 . 学习 化学分析和光谱分析相结合确定苦杏仁苷的结构。

二、 实验原理

本实验是利用苷的极性较大，不溶于非极性溶剂，能溶于极性溶剂的特点，采用石油醚脱脂，用乙醇提取的方法提出苦杏仁苷 。 苦杏仁苷容易被其共存的苦杏仁酶水解，先生成野樱皮苷，进一步酶解成苦杏仁腈、苦仁腈性质不稳定，易分解生成氢氰酸和苯甲酸，来进行鉴定。

苦杏仁苷为固体可以用用熔点来初步鉴定；结构含有苯环、氰基、羟基可以用红外光谱进行鉴定。

三、 实验 原 材料与仪器

实验 原料 ：苦杏仁、葡萄糖（标准品），龙胆二糖（标准品），苯甲酸（标准品）。

实验仪器：索氏提取器，圆底烧瓶（ 500ml ， 100ml ），滤纸，电热套，布氏漏斗，锥形瓶（ 1000ml ），球形冷凝管，电子天平，托盘天平，点滴板，试管， PH 试纸，水浴锅，薄层板，研钵。

实验试剂：乙醚（或石油醚）， 95% 乙醇，改良碘化铋钾，硫酸，苦味酸钠，氢氧化钠，苦杏仁酸，羧甲基纤维素钠，正丁醇，醋酸，邻苯二甲酸苯胺，高锰酸钾，氨水，碘蒸汽。

四、实验过程

1 . 苦杏仁苷的提取和精制

1.1 脱脂：

取苦杏仁 70g 捣碎后放脂肪提取器中，用乙醚（或石油醚）提取苦杏仁中的脂肪油约 60min （直至醚溶液点于滤纸上，挥去醚后不留油迹）。

1.2 提取：

将脱脂后的苦杏仁碎米，挥去溶剂，必要时红外线烘干，放 500ml 圆底烧瓶中，加入约 250ml 95% 乙醇，回流提取 60min ，趁热于布氏漏斗中用三层滤纸抽滤。滤渣如上法再提取一次。合并乙醇提取液，置于 1000ml 锥形瓶中，加少量乙醚（微混）促使结晶，放置过夜，待结晶析出，过滤结晶，得苦杏仁苷粗品。

1.3 精制

取苦杏仁苷粗品放入 100ml 烧瓶中，加 95% 的乙醇约 35-40ml ，水浴回流至完全溶解，抽滤，滤液放置待结晶析出。 60 ℃干燥，称重，计算收率。

2 苦杏仁苷的结构鉴定

2.1 测熔点

2.2 显色反应

(1) 取苦杏仁苷少许，置点滴板上，滴加浓硫酸一滴，呈紫红色。

(2) 取苦杏仁苷少许，加水 1-2ml 时溶解，加改良碘化铋钾试剂 1-2ml ，先呈棕红色，稍后变为棕色沉淀。

2.3 水解反应

(1) 酸水解：取苦杏仁苷约 0 . 1g 置于试管中，加 5% 硫酸 2ml 混匀，在试管上放一条浸过苦味酸钠的滤纸，用棉花塞住管口，于沸水浴中加热，则水解生成的 HCN 使纸条变为红色。

(2) 碱水解：取苦杏仁苷少许，置于试管中，加水润湿，加 5%NaOH 2ml ，在试管上放一条 PH 试纸，用棉花塞住管口，于沸水浴中加热，纸条渐变为蓝色。

2.4 糖的硅胶薄层检查

样 品：苦杏仁酸，水解液

对照品：葡萄糖，龙胆二糖

展开剂：正丁醇 — 醋酸 — 水（ 4:1:1 ）

显色剂：邻苯二甲酸苯胺，喷洒后 105 ℃加热 10 分钟。

2.5 苦杏仁苷氧化液薄层检查

样品：取少量的苦杏仁苷放试管中，加水约 2-5ml ，温热使溶，滴入 一 滴 1N NaOH 溶液，使呈碱性，然后滴几滴 0.5N KMnO ₄ 溶液，观察颜色的变化，氧化液作为样品。

对照品：苯甲酸

展开剂： 95% 乙醇：水： 25% 氨水（ 8:1:1 ）

显色：碘蒸汽

2.6 苦杏仁苷 红外检测

以组为单位做红外 检测 ，学生实际操作 ，主要解析 氰基的特征（ 2200cm ^-1 ）。

实验 二 大黄中总蒽醌的提取与分离

大黄为蓼科植物掌叶大黄（ Rheum Palmafum L) ；鸡爪大黄（ R.tangguticum Maxim ex Regel) ；四川大黄（ R.officinale Baill) 的根茎。大黄中含有多种蒽醌衍生物，其主要有大黄酸（ Rhein) 、大黄素（ Emoclin) 、大黄酚（ Chrysophanol) 、芦荟大黄素（ Aloe-emoclin) 、大黄素甲醚（ Physcion) 、番泻叶苷和鞣质等。 各成分的性质如下：

1. 大黄酸：黄色针晶，熔点 321-322 ^o C ， 330 ^o C （水解），不溶于水，可溶于碱液、吡啶、微溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚等溶剂。具有升华性。

3. 熟悉蒽醌类化合物的鉴定反应。

2.2 实验原理

根据相似相容的原理大黄中各个蒽醌因含有多个羟基而易溶于热乙醇中，利用此性质用乙醇提取大黄中的蒽醌。总蒽醌的苷元在乙醚中有一定溶解度，因而乙醇提取的总蒽醌酸解后用乙醚提取总苷元。

根据总蒽醌的苷元含有羟基的不同，极性不同，在 吸附柱色谱法 上具有不同的保留。 利用固体吸附剂对混合物中的不同极性的各个组分的吸附能力不同而使其分离 。 本实验采用 常用的 硅胶 吸附 柱进行蒽醌苷元的分离 。

2.3 实验 原材料 与 仪器

实验原料：大黄。

实验试剂： 95% 乙醇， 10% 硫酸，乙醚，硅胶（ 160 目），石油醚，乙酸乙酯，苯。

实验 仪器 ：电热套，圆底烧瓶（ 1000ml ， 250ml ），球形冷凝管，分液漏斗，锥形瓶，玻璃柱，薄层板，旋转蒸发器，铁架台，量筒，红外灯。

2.4 实验内容

2.4.1 大黄中总蒽醌的提取

称取粗大黄粉 40 g 置 250 ml 烧瓶中第一次加 95% 的乙醇 120 ml ，水浴回流 60 min ，过滤。如法再回流两次，每次加 95% 乙醇 75 ml ，回流 60min ，合并三次回流提取液，常压浓缩至 20 ml ，得总蒽醌膏状物。

将总蒽醌转移到 250ml 的烧瓶中，加水 30 ml ，加 10% 的硫酸 15 ml ，加热水解 1h 。将水解液转移到 250 ml 分液漏斗中，加乙醚 30 ml ，慢慢振摇，分出乙醚层，水层以同法用乙醚提取 4 次，每次加乙醚（ 30 ml 、 20 ml 、 2 0ml 、 2 0ml ），合并乙醚提取液，回收醚，得总游离蒽醌。

2.4.2 总蒽醌的柱层析

1. 装柱

干法装柱：取 100-140 目硅胶 28g ，轻敲柱体，均匀装入层析柱内。

湿法装柱：少量石油醚装入柱层析柱内，润洗柱子，再以 75ml 石油醚调 160 目硅胶 28g 为糊状，均匀倒入柱内，令硅胶自然下沉。

2. 上样品

干法：秤取游离总蒽醌约 20mg ，加 8ml 乙醇溶解，再加约 1.2 克硅胶搅拌，于红外灯下干燥后加于柱上。

湿法： 20mg 总蒽醌用石油醚 — 乙酸乙酯（ 95:5 ）溶解后上柱。

3. 洗脱

干法柱：向柱内加入石油醚 — 乙酸乙酯（ 95:5 ）适量，开始流出后，进行洗脱。

湿法柱：操作同上。 用湿法上柱。

当第一个色带流入柱底部时，分部收集，每 5ml 一份。当第一个色带洗脱完后，改用石油醚 — 乙酸乙酯（ 85:15 ）继续洗脱石油醚 — 乙酸乙酯（ 8 0 : 20 ）， 洗 至第三个色带洗完后，停止。

4. 薄层检查

吸附剂：硅胶板

展开剂：苯 — 乙酸乙酯 （ 8:2 ）

显色：荧光

5. 合并与浓缩

将部分收集的每份流出物点于硅胶薄板上，展开后，将斑点相同的流份合并，合并后的溶液回收溶剂，放置析出。

三、思考题

1 . 大黄中各个蒽醌的酸性及极性顺序？

实验 三 汉防己生物碱的提取、分离和鉴定

汉防己（粉防己）是防己科千金藤属植物石蟾蜍 Stephania tetrandra S.moore 的根，具有解热镇痛作用，中医用于祛风、止痛、利尿、消肿及治疗毒蛇咬伤等。其有效成分是生物碱，总碱含量约为 2% ，主要有汉防己甲素、汉防己乙素及轮环藤酚碱。汉防己甲素具有镇痛、消炎、降压、肌松、抗菌、抗肿瘤、抗矽肺、抗结核、抗心律失常（ Ca ²⁺ ）抑制血小板凝集等作用。汉防己乙素具有镇痛、消炎、降压、抗肿瘤、抗血小板凝集等作用。轮环藤酚碱具有松弛横纹肌、阻断神经节、降压、抑制胃收缩等作用。汉防己中主要成分的物理性质 如下。

1. 汉防己甲素（粉防己碱， tetrandrine ） :C ₃₈ H ₄₂ O ₆ N ₂ ，无色针状结晶（丙酮），有双熔点现象 。 结晶在 126 ℃～ 127 ℃是熔融 ， 153 ℃是固化 ， 温度上升至 217 ℃～ 218 ℃是复又熔化。 [a] ²⁵ _n 为 +297 ^。 （ c=1.00,CHCl ₃ ） ， 与碘甲烷反应生成碘化二甲基汉防己甲素（汉松肌， C ₄₀ H ₄₈ O ₆ N ₂ ·I ₂ ）。汉防己甲素不溶于水、石油醚，易溶于甲醇、乙醇、乙醚、氯仿和苯中，亦溶于稀酸水溶液中。 UV λ ^EtOH _max nm(lg ε ):282.5  (3.88) 。

2 . 汉防己乙素 ( 防己诺林碱 ,fangchinoline):C ₃₇ H ₄₀ O ₆ N ₂ ，本品为细棒状结晶（丙酮），有双熔点现象，熔点为 134 ℃～ 136 ℃和 238 ℃～ 240 ℃ 。 [a] ²⁵ _n 为 +275 ^. （ c=0.57,CHCl ₃ ） ， 与溴甲烷反应生成溴化二甲基汉防己乙素（汉松敏， C ₃₉ H ₄₆ O ₆ N ₂ ·Br ₂ ）。本品溶解度与汉防己甲素相似，但极性稍大，故在冷苯中的溶解度小于汉防己甲素，具有隐性酚羟基，不溶于 NaOH 溶液中。 UV λ ^EtOH _max nm(lg ε ):282  (3.99) 。

3 . 轮环藤酚碱（汉己素， cyckabikube ） :C ₂₀ H ₂₄ N ⁺ ， 氯化物为无色八面体结晶， mp214 ℃～ 216 ℃ ， 其碘化物为无色丝状结晶， mp185 ℃ ， [a] ³⁰ _n 为 -120 （ c=0.67 ， MeOH ）。易溶于水、甲醇、乙醇，难溶于低级性有机溶剂中。 UV λ ^EtOH _max nm(lg ε ):232  (4.11) ， 284 （ 3.83 ）。

2.1 实验 目的

1 、 掌握总生物碱的提取及脂溶性生物碱和水溶性生物碱、酚性叔胺碱及非酚性叔胺碱、水溶性碱与水溶性杂质的分离、纯化和方法。

2 、 学习用吸附色谱法分离生物碱的操作技术。

3 、 掌握生物碱的鉴定方法。

4 、 学习生物碱衍生物的制备方法。

2.2 实验原理

根据大多数生物碱或生物碱盐均能溶于 乙醇 的通性，利用乙醇回流提取总生物碱。利用季胺型生物碱易溶于水，不溶于亲脂性有机溶剂的性质，用溶剂萃取法分离脂溶性生物碱和水溶性生物碱；根据汉防己甲素和乙素结构上的差异，用吸附柱色谱分离二者，或利用汉防己甲素的极性小于乙素，在冷苯中溶解度比汉防己乙素大加以分离；利用季胺型生物碱可与雷氏铵盐产生沉淀的性质，使季胺型生物碱与其他水溶液成分分离。

2.3 实验原材料及仪器

实验原料：汉防己

实验试剂： 95% 乙醇， 1% 盐酸，二氯甲烷，浓氨水， 1% 氢氧化钠， dragendorff 试剂，丙酮，中性氧化铝，硅胶 G ， CMC-Na ，甲苯， 20% 盐酸，雷氏铵盐， 0.6% 硫酸银， 10% 氯化钡， 10% 氢氧化钾，碘甲烷，甲醇，乙醇，环己烷，无水硫酸钠，苦味酸试剂，碘 - 碘化钾试剂，硅钨酸试剂，碘化铋钾试剂。

实验仪器：量筒，烧杯， 500ml 园底烧瓶，回流冷凝管，锥形瓶， 250ml 分液漏斗， 蒸发皿 ，试管 。

2.4 实验内容

2.4.1 总生物碱的提取

称取汉防己粗粉 100g ，置于 500ml 圆底烧瓶中，加 95% 乙醇浸没药材（约需 300ml ），水浴上加热回流 1h 后，过滤，滤液置于锥形瓶中，药渣再用 95% 乙醇 200ml 同法提取一次，每次 30min ，合并两次滤液。如有絮状物析出，再过滤一次，澄清溶液浓缩至无醇味，成糖浆状，得到总生物碱。

2.4.2 亲酯性生物碱和亲水性生物碱的分离

将糖浆状总提取物置于锥形瓶中，逐渐加入 1% 盐酸 100ml 左右（ 生成季铵盐，溶解在水中 ），同时充分搅拌，促使生物碱溶解。不溶物呈树脂状析出下沉。静置，滤出上清液，再用 1% 盐酸少量多次洗涤不溶物（ 充分溶解残留的生物碱，使其生成季铵盐 ），直至洗液对生物碱沉淀试剂反应微弱为止。

将盐酸提取液置于分液漏斗中，用二氯甲烷洗 3 次（ 二氯甲烷溶解非生物碱成分 ），每次用酸水液的 1/3 量，合并二氯甲烷洗液，再用 1% 盐酸洗二氯甲烷混合液 1-2 次（ 把二氯甲烷中的生物碱让其变为季铵盐溶于水中 ），将洗涤二氯甲烷的酸液和酸水提取液合并，留取 10ml 作沉淀反应，二氯甲烷层弃去（ 不含生物碱，是其他亲酯性成分 ），其余的酸水液移至分液漏斗中，加 75ml 二氯甲烷，滴加浓氨水调至 pH9~10 （ 季铵盐和氨水反应，释放出生物碱 ） ，振摇萃取，静置分层后放出二氯甲烷层（ 亲酯性生物碱溶于二氯甲烷中 ），碱水层在再用新的二氯甲烷萃取 4 次 -5 次（ 彻底把亲酯性生物碱提到二氯甲烷中 ），每次用二氯甲烷萃取 40ml ，直到二氯甲烷萃取液生物碱反应微弱为止（取二氯甲烷液滴在滤纸上喷碘化铋钾（ Dragendorff ）试剂显色不明显）。 氨性碱水液留待分离水溶性生物碱。 二氯甲烷液置于分液漏斗中，先以 1% 氢氧化钠溶液洗两次后 （ 酚性生物碱和 NaOH反应，成盐 ），再用水洗 2 次 ~3 次，碱水液和水液合并，为 含酚性生物碱部分 。二氯甲烷液用无水硫酸钠脱水，蒸去二氯甲烷至干，得 脂溶性粗总碱 （汉防己甲素、汉防己乙素的混合物）。

2.4.3 汉防己甲素和汉防己乙素的分离

方法一 柱色谱分离法

取 100ml总碱，用少量丙酮溶解，将0.5g～1.0g色谱用氧化铝（作吸附剂）置于小蒸发皿中，滴加样品丙酮于吸附剂中分散均匀，加热挥去丙酮，研细样品备用。取中性氧化铝100目30g，装于2.5cm×25cm的色谱柱中，将含有样品的吸附剂均匀的加于柱顶，用环己烷-丙酮（4：1）洗脱，流速控制在5ml/min，收集各流分（10ml ～ 15ml/份），回收溶剂，用硅胶G-CMC-Na薄层板做检查，同时点汉防己甲素、汉防己乙素乙醇溶液作对照。展开剂为二氯甲烷-丙酮（1:1），上行展开，在层析缸里放一小杯氨水，展开前饱和15min，用改良Dragendorff试剂显色，记录图谱及斑点颜色。合并相同流分，回收溶剂至干，分别用丙酮重结晶，可得汉防己甲素、汉防己乙素纯品。

注： 强调氧化铝上柱与硅胶上柱的本质区别：生物碱为碱性只能用碱性氧化铝上柱，如果用硅胶（酸性）可能反应上，难以洗脱。

氨水先饱和薄层板，否则生物碱吸附在硅胶柱上，展不上去。

环己烷 -丙酮=4:1

方法二 溶剂分离法

将粗总碱置于 25ml三角烧瓶中，加5倍量的冷甲苯，密闭冷浸，时时振摇，1h后过滤，以少量甲苯洗涤不溶部分合并甲苯溶液，回收甲苯至无甲苯的臭味，残留物以丙酮重结晶，得细棒状结晶，为汉防己甲素，再经数次重结晶至熔点恒定、色谱显示一个斑点为止。甲苯不溶物待挥去残留的甲苯后，也用丙酮重结晶，可得粒状结晶，为汉防己乙素，再经数次重结晶，测熔点，进行色谱鉴定（薄层色谱条件同。

注： 溶剂无法得到纯晶体，学生实验此方法不做。

经集体备课，高老师和陈老三建议取消这一步操作，量太少，而且此方法也不是常用的方法。只做柱分离。

2.4.4 季胺型生物碱的分离纯化

2.4.2 中的氨性碱水液，加 2 0%盐酸调至 p H3 ～ 4，滴加雷氏铵盐的饱和水溶液至不再生成沉淀为止 （ 季铵盐在酸性条件下与硫氰酸铬铵生成不溶性沉淀，复盐 ） 。滤取沉淀，用少量水洗涤，抽干，自然干 燥 ，称重，加 20倍量的丙酮溶解，自然过滤，滤去不溶物，丙酮液通过氧化铝柱除杂质，并用丙酮溶液（丙酮:水= 5:1）洗至流出液颜色极浅为止，在此洗脱液中加入 0. 6% 硫酸银 ( Mr：203.94，2.9X10 ^-5 mol/ml=0.000029mol/ml ) 溶液至不再生成沉淀（记录硫酸银溶液的体积） （ 复盐和硫酸银反应，生成硫氰酸铬银 ） 。放置，自然过滤，弃去沉淀。滤液回收大部分丙酮 （ 含有硫酸盐生物碱 ） ，放冷（如有沉淀物再过滤），小心加入与硫酸银溶液等量 （ 等物质的量或等摩尔量 ） 的 10% 氯化钡 （ Mr： 208.23,0.00048mol/ml ） 溶液 （ 硫酸盐生物碱转化为盐酸盐生物碱，同时生成硫酸钡沉淀 ） 至白色沉淀不再生成为止，放置，自然过滤，滤液转入蒸发皿中，水浴上浓缩至小体积（约 2ml ～ 3ml），趁热转入小三角瓶中，放置析出无色结晶，得 轮环藤酚碱盐酸盐 ，如有必要可再用水重结晶一次。

注： 经集体备课，建议取消这一步操作 ，含量太少，无法得到晶体 。只做柱分离。

薄色板：硅胶 G-CMC-Na 板。

点样：自提汉防己甲素、汉防己乙素的乙醇溶液，汉防己甲素、汉防己乙素对照样品乙醇溶液。

展开剂： ①氯仿 - 乙醇（ 10:1 ） ②甲苯 - 丙酮 - 乙醇（ 4:5:1 ） ③氯仿 - 丙酮 - 甲醇（ 4:5:1 ）

展开方式：上行法，在层析缸里放一小杯氨水，饱和 15min.

显色：喷改良碘化铋钾试剂。

注： 特别强调氨水饱和的原理，因为是硅胶展板，硅胶是酸性，需要展开的是碱性化合物，因而板子需要事先饱和。

（ 2）轮环藤酚碱的色谱条件

薄层板：硅胶 G-CMC-Na 板。

点样：自提轮环藤酚碱乙醇溶液，轮环藤酚碱的对照品乙醇溶液。

展开剂：甲醇 -氨水（ 7:3 ）

显色：喷改良碘化铋钾试剂。

注： 轮环藤酚碱分离 取消，这一步不做

2.5 附注

1. 提取总生物碱时 ，回收乙醇至稀浸膏状即可，过 干时，当加入 1% 盐酸后会结成胶装团块，影响提取效果。

2. 酸水液用 二氯甲烷 洗涤，是为了去除非碱性脂溶性杂质。 PH = 2 时，生物碱全部成盐，一般不被 二氯甲烷 提取。

3. 用 1% 氢氧化钠溶液洗 二氯甲烷 液目的是 分离 酚性生物碱。汉防己乙素结构中的酚羟基由于空间效应和氢键形成，呈阴性酚羟基性质，酸性减弱，不溶于强碱溶液中，在此步骤中仍留在 二氯甲烷 中。

4. 氧化铝柱净化可选用 1cm×20cm ，氧化铝用量约 5g ，采用干法装柱。

注：用湿法上柱子，快。

2.6 思考题

1.汉防己甲素、汉防己乙素在结构上性质上有何异同？实验过程中，我们应该怎样利用它们的共性和个性？怎样分离？请设计方案。

2 .分离水溶性和脂溶性生物碱的常用方法有哪些？

3 .萃取过程中怎样防止和消除乳化？

芦丁（ Rutin ）亦称芸香甙，属于黄酮类化合物，是槲皮素 3 位羟基与芸香糖（ Rutinose ）脱水缩合成的甙（如图所示）。芦丁广泛存在于植物界，已发现的含有芦丁的植物至少在 70 种以上，以槐米、荞麦叶、蒲公英和烟叶中含量较多，本实验以槐花米作为提取芦丁的原料。

槐花米系豆科植物槐树 Sophora joponia L 的未开放花蕾，除了含有芦丁外，还含有槲皮素、皂苷、白桦醇酯（ Betulin ）、槐二醇（ Sophoradiol ）以及槐米甲、乙、丙素（ SophorinA 、 B 、 C ）和多糖、粘液质等。其中芦丁含量高达 23.5% ，槐花开放后降至 13.0% 。

1． 芦丁

芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶。含 3 分子结晶水（ C ₂₇ H ₃₆ O ₁₆ ·3H ₂ O ）， mp:174~178℃ 。在 110℃10mmHg 下真空干燥 12 小时含水芦丁变成无水芦丁，无水芦丁可从大气中吸收约 2.5 分子水份。无水芦丁在 125℃ 变褐，在 190~192℃ 变成胶状， 214~215℃ 发泡分解。 比旋光度（ º, 乙醇中）： 13.82 。 芦丁溶解度在冷水中 1∶300 ，热乙醇中 1∶30 ，沸甲醇中 1∶7 ，冷吡啶中 1∶12 ，微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚。

芦丁分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液中，酸化后又析出，因此可以用碱溶酸沉的方法提取芦丁。芦丁分子因含有邻二酚羟基，性质不太稳定，暴露空气中，在光的作用下，能缓缓分解，变为暗褐色，在碱性条件下更容易被氧化分解，硼酸盐能与邻二酚羟基结合，达到保护的目的，故在碱性条件溶液中加热提取丁时，往往在加入少量硼砂，就是保护芦丁减少氧化分解。

芦丁具有维持血管的正常通透性、减低血管的脆性的作用，可用作治疗毛细管脆弱引起的出血症和高压病的辅助治疗剂。芦丁还可作为原料来制备槲皮素（ Quercetin ）、羧乙基槲皮素、羧乙基芦丁、二羧丙基芦丁、 β- 乙基吗啉芦丁、 6- 二乙胺基芦丁等。

2 ．槲皮素

为芦丁水解后苷元，黄色结晶。含 2 分子水的槲皮素（ C ₁₅ H ₉ O ₇ ·2H ₂ O ）， mp:313~314℃ ，无槲皮素， mp: 316℃ 。溶于热乙醇（ 1:23 ），冷乙醇（ 1:300 ），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶等，不溶于石油醚、苯、乙醚、氯仿中。

3 ．皂甙

粗制品为白色粉末，分解点为 210~220℃ 。易溶于水、吡啶，能溶于甲醇。酸水解后得白桦醇酯、槐二醇、葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酸内酯。

4 ．白桦醇酯

无色针状结晶， mp ： 251~252℃ ，能溶于乙酸、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、苯中，难溶于水、石油醚中。

5 ．槐二醇

无色针状结晶， mp ： 219~220℃ 或 224℃ ，能溶于石油醚、苯、丙酮、甲醇中，难溶于水。

6 ．槐米甲素

青黄色针状结晶，熔点不定， 181~182℃ 开始发泡， 186℃ 变形发泡完， 198~203℃ 透明有质变色， 244~245℃ 分解融熔。溶解度：冷水中 1∶108 ，热甲醇中 11.2% ，冷乙醇中 1∶290 ，热乙醇中 3.5% ，冷二氧六环中 1∶30 ，热二氧六环中 1∶15 ，易溶于吡淀，微溶于乙醚、乙酸乙酯，不溶于冰乙酸、石油醚和氯仿。

7 ．槐米乙素

无色六面体结晶， mp:272~274℃ ，易溶于浓硫酸，难溶于 85% 磷酸，略溶于热甲醇及乙醇，但冷时难溶，在其它非极性溶剂中均不溶，也不溶于水、 5% 盐酸、 5% 氢氧化钠溶液。

8 ．槐米丙素

无色棒状结晶， mp:235~237℃ ，易溶于甲醇、乙醇及二氧六环，稍溶于乙醚及丙酮，不溶于水、沸水、 5% 盐酸、 5% 氢氧化钠、 85% 磷酸。溶于浓硫酸中呈红色，放置后转变为紫色。

二、实验部分

2.1 实验目的

1 ．通过芦丁的提取与精制掌握黄酮类化合物提取的原理及方法：碱溶酸沉法。

2 ．通过芦丁的鉴别及水解，学习黄酮类化合物的鉴别方法及苷的酸水解方法。

2.2 实验原理

芦丁为黄酮苷，分子中有较多的酚羟基，显弱酸性，易溶于碱水，酸化后又析出，因而可利用碱溶酸沉的方法进行提取；芦丁可被稀酸水解，生成槲皮素、葡萄糖和鼠李糖，可通过薄层析、纸层析鉴定、化学颜色反应和沉淀反应来鉴定。芦丁在冷热水中的溶解度相差较大，可利用此性质进行重结晶来精制芦丁。

2.3 实验原材料及仪器

实验原料：槐米

实验试剂：石灰乳，硼砂， 10% 盐酸， 2% 硫酸，氯仿，甲醇，氨气，三氯化铝，正丁醇，醋酸，氢氧化钡，滑石粉，苯胺 - 邻苯二甲盐试剂，盐酸，镁粉（或锌粉）， 95% 乙醇， 1% 醋酸镁甲醇液，浓硫酸，醋酸铅试剂， 2% 二氯氧锆， 2% 柠檬酸甲醇溶液， 1% 三氯化铁乙醇溶液， 1%NaOH 溶液，氨性硝酸银试剂。

实验仪器：乳体，烧杯（ 500ml ），电炉，温度计，布氏漏斗，滤纸， pH 试纸，电子天平，烘箱，熔点测定仪，圆底烧瓶（ 250ml ），球形冷凝管，电热套，聚酰胺薄层，紫外灯，层析缸，玻璃漏斗，蒸发皿，烘箱，电炉，试管，点滴板。

2.4 实验内容

2.4.1 芦丁的提取

取槐米 25g ，置乳体中压碎，放置在 500ml 烧杯中加自来水 200ml ，于热水浴中加热，在不断搅拌下加石灰乳调 pH 为 8-8.5 ，当温度升到 80 ℃时，加硼砂 0.6g ，搅拌后加热至沸，然后 95 ℃保温 60min ，趁热用 2 层纱布过滤，滤液另器放置，如法再提取一次（ 40min ），两次滤液合并，趁热再用布氏漏斗抽滤得滤液，用 10% 盐酸调 pH 至 6-6.5 ，放置过夜。倾去上清液，芦丁结晶用布氏漏斗抽滤，滤层用水洗 3-4 次，抽干， 90 ℃以下烘干即可，称量芦丁的得量。用水重结晶得纯品，测熔点 ， 比旋光度 。

2.4.2 芦丁的水解

取芦丁 1g 加 2%H ₂ SO ₄ 80ml 于 250ml 的三颈瓶中，加热回流。先小火加热微沸回流约 30min 。开始加热时溶液为澄清溶液，逐渐析出黄色小针状结晶即槲皮素。抽滤，再用少量水洗沉淀，抽干，得槲皮素结晶，于 110 ℃干燥可得无水槲皮素。称量槲皮素的得量，并测槲皮素的熔点。

2.4.3 芦丁的鉴别

2.4.3.1 层析法鉴定

①聚酰胺薄层鉴定

样 品：自制芦丁、槲皮素 95% 乙醇溶液

对照品：芦丁、槲皮素 95% 乙醇溶液

展开剂：氯仿 - 甲醇（ 2 ∶ 1 ）

显 色： a. 紫外灯下观察荧光。 b. 经氨气熏后再观察荧光。 c . 喷三氯化铝试剂后再观察荧光。

②纸层析鉴定

样 品：对照品、显 色：同上。

展开剂：正丁醇 - 醋酸 - 水（ 4 ∶ 1 ∶ 1 或 4 ∶ 1 ∶ 5 上层）

③糖的纸层析鉴定

样品：取上述芦丁水解后除去槲皮素的滤液 20ml ，用 Ba(OH) ₂ 的细粉中和至 pH 为 7 ，以滑石粉（或活性炭）助滤，滤液用水浴浓缩至约 1ml ，供纸层析点样用。

对照品：葡萄糖、鼠李糖水溶液。

展开剂：正丁醇 - 醋酸 - 水（ 4 ∶ 1 ∶ 1 或 4 ∶ 1 ∶ 5 上层）

显色剂：苯胺 - 邻苯二甲酸盐试剂喷后 105 ℃烘 10 分钟，显棕色或棕红色斑点。

2.4.3.1 显色反应鉴别

（ 1 ）盐酸 - 镁粉反应，盐酸 - 锌粉反应。

取芦丁、槲皮素各约 10mg ，加 95% 乙醇 5ml 温热使溶，各加镁粉（或锌粉）约 5mg ，滴加浓盐酸数滴，比较两者颜色的变化，以此区别芦丁与槲皮素。

（ 2 ）醋酸镁反应

取样品数毫克，溶于甲醇中，在试管中或点样于滤纸片上加 1% 醋酸镁甲醇液 2-3 滴，黄酮类（芦丁）呈黄色荧光，二氯黄酮类（陈皮中橙皮苷）呈天蓝色荧光。

（ 3 ）浓硫酸反应

取样品数毫克置于白色点滴板上，滴加浓硫酸反应呈橙色，加较多水稀释后，转为浅黄色，并析出黄色沉淀。

（ 4 ）醋酸铝沉淀反应

取槐米的水浸液 1-2ml, 滴加醋酸铝试剂数滴，观察其有无沉淀反应（一般黄酮类成分水溶液先加醋酸铝试剂至沉淀发生，取其上清液再加碱式醋酸铝溶液数滴，观察有无沉淀发生）。

（ 5 ）锆 - 柠檬酸反应

取槲皮素 0.1mg ，加甲醇加热溶解，再加 2% 二氯氧锆 3-4 滴，凡有 3-OH 或 5-OH 的黄酮即显鲜黄色，然后加入 2% 柠檬酸甲醇溶液 3-4 滴，有 3-OH 的黄酮颜色不褪色，有 5-OH 的黄酮黄色变浅。

（ 6 ）点滴反应

取样品溶液于滤纸上，分别加下列试剂，观察颜色及荧光的变化。

样品：芦丁、槲皮素的 95% 乙醇液。

试剂： 1% FeCl ₃ .C ₂ H ₅ OH, 2% AlCl ₃ . C ₂ H ₅ OH, 1% NaOH, 氨性 AgNO ₃ 试剂。

注：选做几种。

2.4.4 实验说明及注意事项

（ 1 ）以碱溶酸沉法得到的提取液，通常因大量粘稠的杂质难以过滤，给实验操作造成困难，为此也可以改变碱水提取液的处理方法。如果将碱水提取液的粗滤液冷却至室温，再继续加入足量石灰乳使 PH 达到 12 以上，是提取液中的杂质被石灰乳沉淀，再立即加入 20% 硫酸溶液调 PH 至 3 ，令多余的钙盐沉淀出来，在 PH=3 的酸度下芦丁则可以游离出来，于水浴上加热至 50--60℃ 迅速过滤，放置滤液于冰箱中直至沉淀完全析出，抽滤，洗济、干燥后即得芦丁。

（ 2 ）硼砂的作用：既能调节碱性水溶液的 p H ，又能保护芦丁减少氧化，但其价格较高，工业上用较大量的石灰乳加入少量的硼砂同样达到提高质量的要求。

（ 3 ）酸碱性的调节

加入石灰乳使 p H 8-9 ， 既可以达到溶解芦丁的目的，又可以除去槐米中含有的大量的多糖粘液质。但是调 p H 不能过高，否则芦丁与钙离子形成不溶于水的螯合物而析出。

1. 根据芦丁的性质还可以采用何种方法进行提取？试设计提取方法。

2. 用碱溶酸沉法提取芦丁的原理是什么？为什么要控制碱浓度？

3. 芦丁和槲皮素为什么有荧光？