单细胞工具箱|singleR-单细胞类型自动注释

单细胞研究中细胞类型注释是很重要的环节，大致分为人工注释和软件注释。

（1）人工注释需要借助文献检索marker或者结合常用的注释数据库-

cellMarker（http://biocc.hrbmu.edu.cn/CellMarker/），

PanglaoDB（https://panglaodb.se/），

CancerSEA（http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/）等，比较考验研究者的相关背景和精力，优点在于准确性相对较好。

（2）软件自动化注释一般是使用软件内置数据集进行注释，操作相对简单。但是准确性会相对稍差，不过可以作为一种很好的辅助注释手段。

自动化注释的软件很多，本次先简单的分享如何使用singleR进行自动注释。

SingleR是一个用于对单细胞RNA-seq测序（scRNA-seq）数据进行细胞类型自动注释的R包（Aran et al.2019）。依据已知类型标签的细胞样本作为参考数据集，对测试数据集中的细胞进行标记注释。

一 内置数据库

使用SingleR的最简单方法是使用内置参考对细胞进行注释。singleR自带的7个参考数据集，其中5个是人类数据，2个是小鼠的数据： BlueprintEncodeData Blueprint (Martens and Stunnenberg 2013) and Encode (The ENCODE Project Consortium 2012) （人） DatabaseImmuneCellExpressionData The Database for Immune Cell Expression(/eQTLs/Epigenomics)(Schmiedel et al. 2018)（人） HumanPrimaryCellAtlasData the Human Primary Cell Atlas (Mabbott et al. 2013)（人） MonacoImmuneData , Monaco Immune Cell Data - GSE107011 (Monaco et al. 2019)（人） NovershternHematopoieticData Novershtern Hematopoietic Cell Data - GSE24759（人） ImmGenData the murine ImmGen (Heng et al. 2008) （鼠） MouseRNAseqData a collection of mouse data sets downloaded from GEO (Benayoun et al. 2019).鼠）

二 数据库，R包

2.1 singleR包安装

#if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))#    install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("SingleR")
BiocManager::install("Seurat")

2.2 加载数据集，数据

加载数据库，可能会比较慢。建议下载好数据库后进行保存。

library(SingleR)library(celldex)
library(Seurat)
library(pheatmap)
##下载注释数据库
hpca.se <- HumanPrimaryCellAtlasData()
hpca.se
#直接load下载好的数据库load("HumanPrimaryCellAtlas_hpca.se_human.RData")load("BlueprintEncode_bpe.se_human.RData")

2.3 查看seurat结果

使用 单细胞工具箱|Seurat官网标准流程 得到的pbmc的seurat的结果，

（1）查看seuret聚类结果

load("pbmc_tutorial.RData")pbmc
meta=pbmc@meta.data #pbmc的meta文件，包含了seurat的聚类结果
head(meta)
                 orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA percent.mt percent.HB RNA_snn_res.0.5 seurat_clusters   labelsAAACATACAACCAC-1     pbmc3k       2419          779  3.0177759          0               0               0  T_cellsAAACATTGAGCTAC-1     pbmc3k       4903         1352  3.7935958          0               3               3   B_cellAAACATTGATCAGC-1     pbmc3k       3147         1129  0.8897363          0               2               2  T_cellsAAACCGTGCTTCCG-1     pbmc3k       2639          960  1.7430845          0               1               1 MonocyteAAACCGTGTATGCG-1     pbmc3k        980          521  1.2244898          0               6               6  NK_cellAAACGCACTGGTAC-1     pbmc3k       2163          781  1.6643551          0               2               2  T_cells

（2）查看umap和tsne图

plot1 <- DimPlot(pbmc, reduction = "umap", label = TRUE)
plot2<-DimPlot(pbmc, reduction = "tsne",
               label = TRUE)
plot1 + plot2

三 singleR注释

3.1 singleR使用内置数据集注释

#进行singleR注释
pbmc_for_SingleR <- GetAssayData(pbmc, slot="data") ##获取标准化矩阵
pbmc.hesc <- SingleR(test = pbmc_for_SingleR, ref = hpca.se, labels = hpca.se$label.main) #
pbmc.hesc
#seurat 和 singleR的table表
table(pbmc.hesc$labels,meta$seurat_clusters)

3.2 绘制umap/tsne图

pbmc@meta.data$labels <-pbmc.hesc$labels
print(DimPlot(pbmc, group.by = c("seurat_clusters", "labels"),reduction = "umap"))

3.3 使用多个数据库注释

使用BP和HPCA两个数据库综合注释，使用list函数读入多个数据库

pbmc3 <- pbmcpbmc3.hesc <- SingleR(test = pbmc_for_SingleR, ref = list(BP=bpe.se, HPCA=hpca.se), 
                      labels = list(bpe.se$label.main, hpca.se$label.main)) 
table(pbmc3.hesc$labels,meta$seurat_clusters)
pbmc3@meta.data$labels <-pbmc3.hesc$labels